草魚(yú)基因組ENU誘變研究及重復(fù)fgfrl1、igfbp-5基因的克隆和功能分析.pdf

1、草魚(yú)（Ctenopharyngodon idellus）為我國(guó)淡水經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)中產(chǎn)量最大的種類(lèi)，其性成熟個(gè)體較大（＞10kg），性成熟周期較長(zhǎng)，目前還沒(méi)有育成優(yōu)良品種。傳統(tǒng)的育種方式需要較高的成本和較長(zhǎng)的時(shí)間，草魚(yú)基因組中存在大量未知功能的主效基因，解讀它們的功能對(duì)認(rèn)識(shí)草魚(yú)生殖、生長(zhǎng)、發(fā)育及抗逆（?。┑冉?jīng)濟(jì)性狀具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。
　　化學(xué)誘變已經(jīng)廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物和蔬菜育種中，由于魚(yú)類(lèi)體外受精的特點(diǎn)，使其能夠在不同時(shí)期開(kāi)展誘

2、變獲得突變體。目前，魚(yú)類(lèi)化學(xué)誘變主要采用突變能力強(qiáng)的烷化劑。在模式生物斑馬魚(yú)中，ENU誘變能夠產(chǎn)生各式突變性狀的功能突變體。ENU化學(xué)誘變應(yīng)可用于養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)的遺傳育種，以增加養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)的基因遺傳突變率。本研究以0.1～2.0mmol等不同濃度的ENU溶液處理草魚(yú)受精卵15min，在胚胎體節(jié)期的畸形率分別為20.3％～78.5%，胚胎畸形率與ENU濃度成正相關(guān)；出苗存活率則從86.3%～17.2%，與ENU濃度成負(fù)相關(guān)。最后選用0.5mmol

3、濃度ENU溶液處理大量處理受精卵，受精后產(chǎn)生的子代在體節(jié)期胚胎畸形率約為50%，約50%的子代形態(tài)發(fā)育正常，生長(zhǎng)速度產(chǎn)生差異，可供篩選出性狀優(yōu)良的突變個(gè)體。通過(guò)提取20尾1+齡誘變F1子代的基因組DNA，對(duì)4個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育通路相關(guān)基因mstn-1、mstn-2、fst-1、fst-2的部分閱讀框進(jìn)行基因組DNA的PCR擴(kuò)增和測(cè)序。結(jié)果顯示，ENU能夠高效誘導(dǎo)草魚(yú)基因組產(chǎn)生單核苷酸突變，ENU對(duì)上述4個(gè)基因的平均誘變率為0.13%，表明ENU

4、溶液浸泡受精卵可提高草魚(yú)基因組突變效率，進(jìn)而應(yīng)用于草魚(yú)的遺傳改良。
　　成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體類(lèi)似物1（Fibroblast growth factor receptor like1，F(xiàn)GFRL1）是近期發(fā)現(xiàn)的FGFRs家族中的一員。FGFRL1是一類(lèi)缺少細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的生長(zhǎng)因子受體，研究表明它在細(xì)胞增殖、肌肉骨骼系統(tǒng)發(fā)育等方面有重要的作用。本研究采用cDNA末端快速擴(kuò)增法（RACE）克隆了草魚(yú)fgfrl1a/-1b重復(fù)基

5、因全長(zhǎng)cDNA序列。草魚(yú)fgfrl1a和fgfrl1b基因全長(zhǎng)分別為3405bp和2666bp，開(kāi)放閱讀框分別為1461bp和1458bp,可分別編碼486個(gè)和485個(gè)氨基酸殘基。與人類(lèi)和斑馬魚(yú)一樣，草魚(yú)成熟Fgfrl1a和-1b多肽也包含三個(gè)Ig-like結(jié)構(gòu)域，一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，兩個(gè)酪氨酸殘基和一個(gè)富含組氨酸的細(xì)胞內(nèi)位點(diǎn)。它們都含有6個(gè)保守的半胱氨酸殘基。草魚(yú)Fgfrl1a和-1b的編碼區(qū)與斑馬魚(yú)的相比相似度分別為96%和91%，與人

6、類(lèi)FGFRL1的相似性較低（分別為66%和59%），但它們之間的相似度僅為56%。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明，草魚(yú)fgfrl1a和-1b基因都在胚胎發(fā)育的受精卵時(shí)期有表達(dá)，隨著體節(jié)發(fā)育時(shí)期而表達(dá)量上升，然后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。在成年草魚(yú)中，fgfrl1a和-1b在所有組織中表達(dá)，但組織表達(dá)差異較大，fgfrl1a mRNA在腦、心臟和肌肉中表達(dá)豐富，而fgfrl1b mRNA則在眼、肌肉和鰓中表達(dá)量高。整胚原位雜交結(jié)果顯示，在草魚(yú)fgfrl1

7、a mRNA主要在胚胎的腦等神經(jīng)組織和脊索體節(jié)等外胚層和中胚層細(xì)胞組織表達(dá)，而fgfrl1b的mRNA在晶狀體和內(nèi)胚層表達(dá)。饑餓處理幼年草魚(yú)6天，然后恢復(fù)投喂的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，fgfrl1a和-1b mRNA在肌肉和腦中都在饑餓過(guò)程中表達(dá)量升高，第6天達(dá)到最高，隨著恢復(fù)投喂?jié)u漸回到正常水平。hGH處理實(shí)驗(yàn)顯示，fgfrl1a和-1b mRNA表達(dá)量都降低，且降低幅度與注射濃度成正相關(guān)。本研究為深入探索草魚(yú)重復(fù)fgfrl1s基因的功能和分子育種

8、奠定了一定的理論基礎(chǔ)。
　　IGFs在進(jìn)化過(guò)程中具有高度保守的特點(diǎn)，尤其在胚胎、神經(jīng)和骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育，細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)化等方面有重要作用。IGFBP-5(Insulin-like growth factor binding protein-5)是IGFBP-家族中最保守的成員，是一個(gè)多功能分泌型蛋白質(zhì)，能夠增強(qiáng) IGF的功能。本文利用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR實(shí)驗(yàn)對(duì)草魚(yú)成魚(yú)不同組織igfbp-5s基因表達(dá)量進(jìn)行研究，所有檢測(cè)的組織中ig

9、fbp-5a mRNA在肝臟中表達(dá)量最高，其次是腦，在腎臟和眼睛中表達(dá)較高；而igfbp-5b mRNA在所有組織中均有表達(dá)，其中在肌肉、腎臟、肝臟、腦和眼睛中表達(dá)量相對(duì)較高，其他組織表達(dá)量較低。草魚(yú)整胚原位雜交結(jié)果顯示，igfbp-5a mRNA在胚胎發(fā)育過(guò)程中主要在體節(jié)和腦中表達(dá)，而igfbp-5b mRNA在脊索，體節(jié)和腦中表達(dá)明顯。同樣利用饑餓及恢復(fù)投喂實(shí)驗(yàn)的方法，igfbp-5a和-5b mRNA在不同組織中呈現(xiàn)不同趨勢(shì)，在肝