番茄CNGC基因家族的基因組水平鑒定及其抗病功能分析.pdf

1、環(huán)核苷酸門(mén)控離子通道（Cyclic nucleotide-gated ion channel，CNGC）是動(dòng)植物中最重要的鈣離子通道之一。目前，只有在一些非作物的植物中系統(tǒng)鑒定了該基因家族，并已有個(gè)別基因在發(fā)育、抗逆和抗病中的功能得到了研究。但是，在組學(xué)水平上的鑒定以及系統(tǒng)的功能分析，尤其是在重要的經(jīng)濟(jì)作物上的抗病相關(guān)功能分析尚未有報(bào)道。本研究在基因組水平對(duì)16種植物的CNGC家族成員進(jìn)行了鑒定分析，并對(duì)番茄CNGC基因家族成員的功能進(jìn)

2、行了分析，得到了如下主要結(jié)論:
　　(1)在基因組水平對(duì)重要經(jīng)濟(jì)作物番茄的CNGC家族的鑒定及其表達(dá)譜分析。采用生物信息學(xué)方法在番茄基因組中鑒定了18個(gè)CNGC家族成員。通過(guò)PCR克隆和核酸序列測(cè)定，糾正了四個(gè)SGN數(shù)據(jù)庫(kù)中被錯(cuò)誤注釋的CNGC位點(diǎn)（SlCNGC5，SlCNGC6和SlCNGC15）的全長(zhǎng)序列信息。對(duì)番茄CNGC家族成員的基因結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)域組成以及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行了詳細(xì)的生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明，與擬南芥CNGC家族

3、相比，番茄CNGC家族的成員數(shù)量更少、外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)相差較大，但有相似的分組。番茄CNGC家族成員均含有必要的結(jié)構(gòu)域，包括一個(gè)cNTP結(jié)合結(jié)構(gòu)域和一個(gè)跨膜離子轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域，以及一個(gè)CNGC特異性基序(motif)。和擬南芥CNGC家族一樣，番茄CNGC家族也分成5組（Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳa和Ⅳ b組）。而且，對(duì)番茄CNGC基因啟動(dòng)子上游1kb序列包含的順式作用元件預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，這些基因啟動(dòng)子區(qū)域包括許多能夠響應(yīng)脫落酸、生長(zhǎng)素、赤霉素、乙烯和

4、細(xì)胞分裂素等多種激素以及各類(lèi)生物脅迫、非生物脅迫和多種WRKY轉(zhuǎn)錄因子的順式作用元件。分析了番茄CNGC基因?qū)Σ煌佬l(wèi)信號(hào)分子（BTH、乙烯、茉莉酸）、病原物Sclerotiniasclerotiorum分泌的毒素草酸以及病原物S.sclerotiorum、Pseudomonas syringaepv.tomato DC3000和Xanthomonas oryzae pv.oryzae的早期(處理后4h)響應(yīng)表達(dá)。結(jié)果顯示，不同番茄CN

5、GC基因?qū)Σ煌碳ぬ幚頃?huì)產(chǎn)生不同的表達(dá)譜。
　　(2)在基因組水平對(duì)15種植物的CNGC家族的鑒定及其系統(tǒng)發(fā)生分析，以明確植物CNGC的進(jìn)化。根據(jù)是否存在必需的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域以及一個(gè)在CNB結(jié)構(gòu)域中橫跨磷酸結(jié)合部位(phosphate binding cassette，PBC)和鉸鏈區(qū)的CNGC特異性基序的標(biāo)準(zhǔn)，從15種植物中鑒定了333個(gè)CNGC基因。這些植物包括3種單子葉植物——短柄草(Brachypodium distachyo

6、n)，玉米和高粱以及12種雙子葉植物——藍(lán)花耬斗菜(Aquilegia coerulea)，馬鈴薯，巨桉（Eucalyptusgrandis），甜橙，雷蒙德氏棉，蕪菁，蘋(píng)果，黃瓜，大豆，毛果楊，亞麻和蓖麻。對(duì)Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋錯(cuò)誤的8個(gè)基因位點(diǎn)（ZmCNGC1，ZmCNGC8，CsCNGC15和CusCNGC16）的序列信息進(jìn)行了相應(yīng)糾正。對(duì)鑒定的所有植物CNGC基因進(jìn)行了廣泛的生物信息學(xué)分析，包括基因結(jié)構(gòu)、CNGC特異性基

7、序及其組成模式、和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的分析。結(jié)果表明，Ⅳa組基因在基因結(jié)構(gòu)方面包括內(nèi)含子的數(shù)量和相位(phase)以及CNB結(jié)構(gòu)域中PBC和鉸鏈區(qū)的氨基酸序列長(zhǎng)度和保守基序上與其他組的成員有顯著差異。具體來(lái)說(shuō)，與其他組基因相比，Ⅳa組基因攜帶更多內(nèi)含子（大部分為11個(gè)），具有獨(dú)特的相位模式（大部分為0-0-0-0-0-0-2-2-0-1-2），PBC和鉸鏈區(qū)氨基酸序列的長(zhǎng)度（52個(gè)氨基酸）也明顯更長(zhǎng)。另外，根據(jù)保守氨基酸序列保守率大于90％的

8、標(biāo)準(zhǔn)，植物CNGC特異性保守基序?yàn)閇L]-X(0，1，2)-[G]-X(3)-G-X(0，1，2)-[E]-L-[L]-X-[W]-X-[L]-X(7，37)-[S]-X(10，11)-[E]-[A]-[F]-X-[L]，而包括代表所有植物CNGC組成情況的保守基序則為:[LIMV0]-X(2)-[GSANCR]-X-[FVIYASCL]-X-G-X(0，1)-X(0,1)-[EDAQGH]-L-[LIVFA]-X-[WRCMLS0]-

9、X-[LMSIQAFT0]-X(7,37)-[SAC]-X(9)-[VTIALMS]-X(0，1)-[EQDN]-[AGSVT]-[FYL]-X-[LIVF]。同時(shí)我們也鑒定出了不同組CNGC蛋白中的保守基序。此外，對(duì)全長(zhǎng)CNGC蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，15種開(kāi)花植物的CNGC蛋白聚類(lèi)成4個(gè)主要組(Ⅰ-Ⅳ)，組Ⅳ的CNGC蛋白又分成兩個(gè)亞組（Ⅳa和Ⅳb）。然而，無(wú)維管束植物（苔蘚）只含有第Ⅳ組的CNGC蛋白，但是低等的維管束無(wú)花植物

10、（石松類(lèi)）卻包含第Ⅳ和Ⅱ組CNGC蛋白，但沒(méi)有第Ⅰ和Ⅲ組CNGC蛋白。以上結(jié)果表明，第Ⅳ組的CNGC蛋白是所有綠色植物CNGC的祖先，后來(lái)維管束植物進(jìn)化出了第Ⅱ組的CNGC蛋白，再后來(lái)的開(kāi)花植物進(jìn)化出了第Ⅰ和Ⅲ組CNGC蛋白。此外，CNGC家族的不同組別成員在植物中的擴(kuò)展情況有明顯差異。
　　(3)鈣離子通道在植物抗病中作用的藥理學(xué)分析。采用藥理學(xué)方法分析了鈣離子通道在番茄葉片抗病性中的作用。供分析的藥理效應(yīng)子包括:鈣離子螯合劑E

11、GTA;鈣離子通道阻遏劑LaCl3;鈣離子ATPase阻遏劑NaVO3; CNGC激活劑親脂性的二溴-cGMP、聯(lián)丁酰-cAMP和腺苷酸環(huán)化酶抑制劑四氧嘧啶。這些效應(yīng)子被提前浸潤(rùn)到番茄葉片中，隨后評(píng)估番茄對(duì)死體營(yíng)養(yǎng)型真菌核盤(pán)菌（Sclerotinia sclerotiorum）的抗病性。結(jié)果表明，CNGC激活劑cGMP(1 mM)和cAMP(100μM)以及鈣離子阻遏劑NaVO3(50μM)增強(qiáng)了番茄對(duì)核盤(pán)菌的抗性。這些藥理學(xué)研究結(jié)果表

12、明，鈣離子通道可能在植物抗病性中起重要作用。
　　(4)采用病毒誘導(dǎo)的基因沉默(VIGS)技術(shù)比較分析了Ⅳa和Ⅳ b組番茄CNGC基因在抗生物和非生物脅迫中的功能。Ⅳ b組CNGC基因SlCNGC16，SlCNGC17和SlCNGC18的沉默顯著增強(qiáng)了番茄對(duì)死體營(yíng)養(yǎng)型病原物的抗性，但是降低了對(duì)TRV病毒的抗性。其中，Sl CNGC17和SlCNGC18負(fù)調(diào)控植株對(duì)死體營(yíng)養(yǎng)型病原物的抗病性，但正調(diào)控對(duì)TRV病毒的抗性，卻不影響對(duì)細(xì)菌

13、Pst DC3000和Xoo的抗性。SlCNGC16的作用與SlCNGC17和SlCNGC18相似，區(qū)別在于SlCNGC16只調(diào)控番茄對(duì)死體營(yíng)養(yǎng)型病原菌核盤(pán)菌的抗性，而對(duì)另一種死體營(yíng)養(yǎng)型病原菌Pythium aphanidermatum的抗性卻無(wú)顯著作用。與單基因沉默相比，三個(gè)Ⅳ b組CNGC基因的共沉默導(dǎo)致更強(qiáng)烈的對(duì)核盤(pán)菌的抗性，說(shuō)明它們?cè)诳共≌{(diào)控中功能重疊冗余。然而，與Ⅳ b組CNGC基因不同，一個(gè)Ⅳ a組CNGC基因（SlCNGC

14、15）的沉默不影響對(duì)所有上述病原物的抗性，但降低了植物對(duì)非生物脅迫（干旱）的抗性。這些結(jié)果表明，Ⅳ a組和Ⅳ b組番茄CNGC基因的功能有顯著區(qū)別:Ⅳ a組基因主要調(diào)控非生物脅迫抗性;而Ⅳa組基因則主要調(diào)控對(duì)多種病原物的生物脅迫抗性。
　　(5)番茄CNGC基因的作用機(jī)制分析。Ⅳ b組CNGC基因的沉默顯著降低了植株中PAMP(flg22，100 nM)和DAMP(AtPEP1，10nM)誘導(dǎo)的H2O2積累，而且顯著改變了一組鈣離