牙鲆IGFBP-1、HIF-1α基因的克隆及功能研究.pdf

1、胰島素樣生長因子(IGFs)系統(tǒng)是脊椎動物生長和發(fā)育所必需的,而IGFBP-1是該系統(tǒng)中的重要成員,不僅與動物機體的生長發(fā)育密切相關,還對氧氣濃度影響敏感,是低氧誘導因子-1(HIF-1)調節(jié)的重要靶基因。在低氧脅迫下,HIF-1通過誘導 IGFBP-1的表達而使機體細胞適應低氧環(huán)境。牙鲆是我國重要的經濟海水增養(yǎng)殖魚類,也是鰈形目魚類中有關變態(tài)研究相對集中的種類,本課題組已構建了IGF-1及其受體在牙鲆發(fā)育變態(tài)中的表達譜,分析了IGFs

2、系統(tǒng)在牙鲆發(fā)育和仔魚變態(tài)中的潛在作用,但IGFBP-1對牙鲆生長發(fā)育的調節(jié)以及IGFBP-1和HIF-1參與的低氧調控機制至今未見報道。因此,本實驗克隆了牙鲆IGFBP-1和HIF-1α基因的cDNA序列,檢測了二者在牙鲆不同發(fā)育時期、不同組織的基因表達,并分析了在低氧脅迫下,IGFBP-1和HIF-1α基因的表達變動規(guī)律及與氧代謝相關的幾種酶類活性的變化,為進一步研究 IGF系統(tǒng)在牙鲆生長發(fā)育中的作用,以及闡述HIF-1α調節(jié)的IGF

3、BP-1基因表達對牙鲆適應低氧的分子機制奠定基礎。其主要研究結果如下:
　　本實驗利用RACE技術,從牙鲆的肝臟組織中克隆得到IGFBP-1、HIF-1α基因的cDNA序列。其中IGFBP-1cDNA全長為1070 bp,包含一段69 bp的5'非翻譯區(qū)(UTR)和一段272 bp的3'非翻譯區(qū),開放閱讀框為729 bp,編碼242個氨基酸,對其同源性分析發(fā)現,與其它脊椎動物都有較高相似性,與大菱鲆、五條鰤、黃金鱸、紅點鮭、鯉魚、

4、斑馬魚的同源性分別為89％、89%、84%、79%、67%、67%。牙鲆HIF-1α基因的cDNA的全長為2330 bp,包含一段225 bp的5'非翻譯區(qū)和一段110 bp的3'非翻譯區(qū),開放閱讀框為1995 bp,編碼664個氨基酸,同源性比對分析,發(fā)現與其它魚類和哺乳動物有很高的相似性,預測的氨基酸與川鰈、白梭吻鱸、河鱸、大西洋鮭、鯉魚和人的相似性分別為90%、83%、83%、71%、62%和53%。
　　熒光定量PCR結果

5、顯示,IGFBP-1 mRNA在牙鲆成魚肝臟中表達量最高,是肌肉中的468.7倍(P<0.05);其次在胃、脾、腸、性腺、腎、鰓、腦、心臟和肌肉中也有不同程度的表達,彼此間無顯著差異。IGFBP-1 mRNA在胚胎和仔魚發(fā)育期間的表達結果顯示,除IGFBP-1在至原腸期(26 h)的早期階段具有相對較高的mRNA水平外,IGFBP-1基因在胚胎發(fā)育的各階段僅有較低水平的表達,在出膜后第3天達到一個高峰,接下來從第7天一直到第20天,IG

6、FBP-1 mRNA都保持在一個較低的水平,從第23天開始,IGFBP-1基因的表達逐漸增多,到變態(tài)高峰期(29 DPH)達到最高峰,隨后至變態(tài)結束(41 DPH)牙鲆IGFBP-1基因的表達又有所降低,由此可推測 IGFBP-1基因可能在牙鲆胚胎和仔魚發(fā)育中有重要作用。半定量檢測HIF-1α mRNA表達結果顯示HIF-1α基因在牙鲆胚胎、仔魚及成體各組織中均有表達,在仔魚出膜7天后,表達量持續(xù)較高,在成體所測各組織中除肝臟外,都有較

7、高表達。
　　甲狀腺激素在牙鲆變態(tài)發(fā)育中起重要作用,同時 IGF系統(tǒng)也容易受到甲狀腺激素的影響,因此,本實驗采用甲狀腺激素處理牙鲆變態(tài)前仔魚,并采用熒光定量PCR方法分析了IGFBP-1 mRNA在甲狀腺激素處理后不同時間點的表達。結果發(fā)現甲狀腺激素明顯促進IGFBP-1的表達,其 mRNA水平在23,29,36和41天與對照組相比有顯著性差異(1.5倍到13.3倍不等，P<0.05)。
　　本研究還檢測了正常氧(11.18

8、±0.25)mg·L-1,70%氧(7.82±0.18)mg·L-1,50%氧(5.57±0.22)mg·L-1條件下與氧代謝有關的酶活力的變化,分別處理48小時,結果顯示總抗氧化能力在肝臟中與常氧條件下相比有有顯著性差異,上升了23.1%~225%(P<0.05),乳酸脫氫酶在肝臟和肌肉中與常氧條件下相比上升了13.4%~60.3%(P<0.05),超氧化物歧化酶在肝臟和肌肉中與常氧條件下相比上升了14.5%~81.4%(P<0.05

9、),過氧化氫酶活性與正常組相比有所降低。本研究同時對低氧條件下牙鲆IGFBP-1 mRNA表達做了定量檢測,結果顯示,在肝臟中,IGFBP-1基因的表達都有不同程度的降低,且均與正常組有顯著性差異(P<0.05)。在鰓中，IGFBP-1 mRNA的表達也都有不同程度的降低。在肌肉中,IGFBP-1基因在50%氧環(huán)境中,低氧處理24h表達量最低,為對照組的14.9%,然而在48h增長為對照組的440.8%,在70%低氧處理組,24h后IG