甘薯胚性懸浮細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因植株的有效再生.pdf

1、該研究以甘薯品種栗子香的胚性懸浮細(xì)胞為材料,用根癌農(nóng)桿菌菌株EHA101對(duì)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘薯遺傳轉(zhuǎn)化進(jìn)行了系統(tǒng)的研究.該菌株所攜帶的pROA93質(zhì)粒上含有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(NPTⅡ)和β-葡萄糖甘酸酶基因(GUS).結(jié)果表明,將達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的根癌農(nóng)桿菌菌液釋釋至OD<,600nm>=0.5,與繼代培養(yǎng)3d后的胚性懸浮細(xì)胞共培養(yǎng),轉(zhuǎn)化效率最高,適宜的共培養(yǎng)時(shí)間為4d.將共培養(yǎng)后的材料在含有300mg/L Carb和2.0mg/L

2、2,4-D的MS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)5~8d,再進(jìn)行選擇培養(yǎng),有利于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的增殖.將轉(zhuǎn)化材料在含有300mg/L Carb、25~75mg/L Kan和2.0mg/L 2,4-D的MS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇培養(yǎng),結(jié)果表明,Carb和Kan的適宜濃度分別為100mg/L和50mg/L.選擇培養(yǎng)2~4周后,共獲得2453個(gè)直徑約1mm的小細(xì)胞團(tuán),將這些小細(xì)胞轉(zhuǎn)達(dá)轉(zhuǎn)移到添加100mg/L Carb、50mg/L Kan和2.0mg/L 2,4-D

3、的MS固體培養(yǎng)基上,經(jīng)過8~20周的選擇培養(yǎng),獲得46個(gè)Kan抗性愈傷組織.將得到的Kan抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到添加100mg/L Carb、25mg/L Kan和1.0mg/L ABAr MS固體培養(yǎng)基上,Kan抗性愈傷組織分化形成體細(xì)胞胚并發(fā)芽,最后轉(zhuǎn)移到添加50mg/L Kan的MS基本培養(yǎng)基上,獲得了138株再生植株.PCR和PCR-Southern檢測(cè)結(jié)果,其中的104株(75.4％)再生植株是轉(zhuǎn)基因植株.利用該轉(zhuǎn)化體系,對(duì)水稻巰

4、基蛋白酶抑制劑(OCI)基因的遺傳轉(zhuǎn)化進(jìn)行了研究.根癌農(nóng)桿菌LBA4404攜帶質(zhì)粒pBinh,該質(zhì)粒攜帶OCI和NMTII基因.將達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的根癌農(nóng)桿菌菌液釋釋至OD<,600nm>=0.5,與繼代培養(yǎng)3d后的胚性懸浮細(xì)胞共培養(yǎng)4d.將共培養(yǎng)后的材料在含有300mg/L Carb和2.0mg/L/L 2,4-D的MS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)5~8d,然后將轉(zhuǎn)化材料在含有300mg/L Carb、50mg/L Kan和2.0mg/L 2,4-

5、D的MS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇培養(yǎng),總共獲得1847個(gè)直徑約1mm的小細(xì)胞團(tuán).將這些小細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)移到添加100mg/L Carb、50mg/L Kan和2.0mg/L 2,4-D的MS固體培養(yǎng)基上,經(jīng)過8~20周的選擇培養(yǎng),獲得19個(gè)Kan抗性愈傷組織.將得到的Kan抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到添加100mg/L Carb、25mg/L Kan和1.0mg/L ABA的MS固體培養(yǎng)基上,Kan抗性愈傷組織分化形成體細(xì)胞胚并發(fā)芽,最后轉(zhuǎn)移到添加50mg

6、/L Kan的MS基本培養(yǎng)基上,獲得了31株再生植株.PCR和PCR-Southern檢測(cè)結(jié)果表明,其中的16株(51.6％)再生植株是轉(zhuǎn)基因植株.通過OCI轉(zhuǎn)基因植株和陰性對(duì)照植株中水稻巰基蛋白酶抑制劑的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳,結(jié)果表明OCI蛋白在轉(zhuǎn)基因植株中有一定量的累積.將GUS轉(zhuǎn)基因植株和OCI轉(zhuǎn)基因植株轉(zhuǎn)移到溫室,結(jié)果發(fā)現(xiàn)大部分轉(zhuǎn)基因植株沒有出現(xiàn)形態(tài)特征的變異.然而,在部分OCI轉(zhuǎn)基因植株和GUS轉(zhuǎn)基因植株上都發(fā)現(xiàn)葉片脈基色