甘薯胚性懸浮細(xì)胞遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立及表達(dá)OCⅠ基因轉(zhuǎn)基因植株的再生.pdf

1、本研究以甘薯品種栗子香和徐薯18的胚性懸浮細(xì)胞為受體材料，建立了一個(gè)有效的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘薯遺傳轉(zhuǎn)化體系。利用該轉(zhuǎn)化體系，將水稻巰基胰蛋白酶抑制劑(OC’I)基因?qū)氲礁适砥贩N中，獲得了對甘薯莖線蟲病具有一定抗性的轉(zhuǎn)基因植株。主要結(jié)果如下： 1．以栗子香的胚性懸浮細(xì)胞為材料，建立了甘薯有效的遺傳轉(zhuǎn)化體系。利用Gus檢測分析了乙酰丁香酮濃度對gusA基因瞬時(shí)表達(dá)的影響，結(jié)果表明在共培養(yǎng)基中添加乙酰丁香酮能夠顯著提高轉(zhuǎn)化效率，適宜

2、的乙酰丁香酮濃度為30 mg I<'-1>。對栗子香和徐薯18胚性細(xì)胞團(tuán)的潮霉素敏感性進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，選擇培養(yǎng)基中適宜的潮霉素濃度分別為25 mg <'-1>和7 mg l<'-1>。用根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105(攜帶pCAMBIAl301，含有潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(hpt)基因和B．葡萄糖苷酸酶(gusA)基因)侵染栗子香的1776個(gè)胚性細(xì)胞團(tuán)，通過選擇培養(yǎng)，獲得了289個(gè)抗性愈傷組織。將這些抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基上，經(jīng)過體細(xì)

3、胞胚胎發(fā)生途徑，再生出2218株擬轉(zhuǎn)基因植株。GuS檢測、PCR、dot blot和Southem blot分析表明，gusA基因已經(jīng)整合到甘薯基因組中，T-DNA插入拷貝數(shù)為1-4個(gè)；轉(zhuǎn)基因植株占擬轉(zhuǎn)基因植株的90.37％。將轉(zhuǎn)基因植株移栽到大田，對其塊根進(jìn)行GUs檢測，結(jié)果表明gusA基因在塊根中穩(wěn)定表達(dá)。 2．將質(zhì)粒pBinh的水稻巰基胰蛋白酶抑制劑(OC I)基因的酶切片段插入到質(zhì)粒pCAMBIA1301的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)

4、建了質(zhì)粒pCAMBIAl301-OCI，并將其導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105中，構(gòu)建了植物遺傳轉(zhuǎn)化雙元載體EHA105/pEAMBIA1301-OCI。 3．利用本研究所建立的遺傳轉(zhuǎn)化體系，將OCI基因?qū)肜踝酉愫托焓?8中。用根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105(攜帶pCAMBIA1301-OCI)分別轉(zhuǎn)化1450個(gè)栗子香的胚性細(xì)胞團(tuán)和1710個(gè)徐薯18的胚性細(xì)胞團(tuán)，通過選擇培養(yǎng)，分別獲得了228個(gè)和489個(gè)抗性愈傷組織。這些抗性愈傷組

5、織經(jīng)過體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑，分別再生出1715株和2119株擬轉(zhuǎn)基因植株。通過GUS檢測以及PCR、Southern blot和Northern blot分析表明，OCI基因已整合到甘薯基因組中；轉(zhuǎn)基因植株百分率分別為90.29％和92.78％。將這些轉(zhuǎn)基因植株移栽到大田，對徐薯18轉(zhuǎn)基因植株的塊根進(jìn)行甘薯莖線蟲接種試驗(yàn)，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株塊根的感病面積只有24.45-65.04％，而對照(非轉(zhuǎn)基因植株的塊根)高度感病，表明表達(dá)OCI基