草莓轉(zhuǎn)基因再生體系的建立及早花基因PcFT的轉(zhuǎn)化.pdf

1、草莓(Fragaria×ananassaDuch)是世界上最重要的草本果樹之一，生長(zhǎng)周期短，果實(shí)風(fēng)味濃郁、香味獨(dú)特，是最好的城市圈經(jīng)濟(jì)栽培的漿果。草莓花芽分化需低溫和短日照，在露地栽培條件下4月底5月初成熟，供應(yīng)期較短；促成和半促成栽培條件下，雖然果實(shí)成熟期可擴(kuò)大至11月底～次年5月，但其余季節(jié)里仍無果實(shí)供應(yīng)。如何調(diào)控其花芽分化，在適宜的時(shí)間結(jié)果，擴(kuò)大其市場(chǎng)供應(yīng)期，提高經(jīng)濟(jì)效益，是科研和生產(chǎn)中需要解決的一個(gè)重要課題。植物基因工程的發(fā)展和

2、應(yīng)用為草莓育種開辟了一條新途徑。由于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化主要依賴于受體材料的再生能力及農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化效率，因此，良好而高效的受體再生體系的建立是進(jìn)行成功的基因轉(zhuǎn)化關(guān)鍵所在。本試驗(yàn)以草莓品種‘紅頰’和‘豐香’為試材，以草莓葉片和花藥為外植體，研究了離體再生過程中基因型、外植體、激素配比、暗培養(yǎng)時(shí)間等對(duì)不定芽再生效率的影響，建立了草莓葉片高效離體再生體系。在此基礎(chǔ)上，對(duì)影響農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率的主要因素進(jìn)行篩選，建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化體系，將早實(shí)枳

3、中分離獲得的早花基因PcFT導(dǎo)入草莓，獲得轉(zhuǎn)化植株。Km篩選、PCR檢測(cè)證明目的基因已經(jīng)整合到草莓基因組中。 主要研究結(jié)果如下： 1.研究了草莓‘紅頰’花藥再生的影響因素 以花粉發(fā)育時(shí)期為單核靠邊期的草莓紅頰花藥，在培養(yǎng)基MS+1.0mg/LTDZ+0.4mg/LIBA上誘導(dǎo)效果最佳，綠苗分化率達(dá)到12.3％，單倍體誘導(dǎo)率為1.11％。 2.建立了草莓葉片離體再生體系 在不定芽誘導(dǎo)中以MS+1.5

4、mg/LTDZ+0.4mg/LIBA對(duì)草莓‘紅頰’葉片誘導(dǎo)效果最佳，適量暗培養(yǎng)有助于提高再生頻率，暗培養(yǎng)4周再生頻率可達(dá)為67.8％；以MS+1.0mg/LTDZ+0.6mg/LIBA，暗培養(yǎng)3周對(duì)豐香誘導(dǎo)效果最好，再生頻率可達(dá)78.7％。草莓‘紅頰’再生難度及價(jià)值比‘豐香’高，選擇草莓紅頰進(jìn)行進(jìn)一步遺傳轉(zhuǎn)化的研究。 3.構(gòu)建了表達(dá)載體pBI121-FT。 4.建立了草莓遺傳轉(zhuǎn)化體系，并獲得一棵草莓品種‘紅頰’轉(zhuǎn)化植株。

5、 在根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化中，確定了有效的Km選擇壓為10mg/L。通過抑菌實(shí)驗(yàn)，確定了合適的抗菌素及其濃度，即400mg/LCef。 對(duì)影響農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率的各種因素進(jìn)行篩選，得到了一條最佳的轉(zhuǎn)化途徑：葉片在分化培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為3天；農(nóng)桿菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用MS+TDZ1.5mg/L+IBA0.4mg/L液體培養(yǎng)基重新稀釋懸浮培養(yǎng)；調(diào)整菌液濃度為OD600=0.3-0.5；侵染葉盤組織約10分鐘；共培養(yǎng)3天；然后

6、，延遲2周篩選，即將外植體接到含有400mg/LCef的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，2周后再轉(zhuǎn)接到含有選擇壓10mg/LKm和400mg/LCef的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行選擇培養(yǎng)。 5.轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR檢測(cè) 經(jīng)10mg/LKm選擇壓初步篩選出10棵‘紅頰’轉(zhuǎn)化植株，以未轉(zhuǎn)化植株為陰性對(duì)照，質(zhì)粒DNA為陽性對(duì)照，PcFT基因的兩端序列作為特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果表明：在這些植株中有1棵植株經(jīng)PCR擴(kuò)增出的特異條帶和陽性對(duì)照