顛茄胚性懸浮細胞遺傳轉化系的研究.pdf

1、本研究以顛茄無菌苗為材料，運用植物組織培養(yǎng)技術，建立顛茄胚性細胞的懸浮培養(yǎng)系并誘導胚性懸浮細胞的再生植株，在此基礎上選用顛茄的胚性懸浮細胞團作為遺傳轉化的受體，通過對農桿菌（C58C1-pCAMBIA1304+-Abpmt）介導顛茄胚性細胞的轉化條件的篩選，建立其遺傳轉化體系，經潮霉素等抗性篩選和分子檢測獲得其轉基因的毛狀根。探究農桿菌介導顛茄胚性懸浮細胞遺傳轉化的條件，并闡明pmt基因在顛茄TAs生物合成途徑中的作用，為培育TAs高產

2、的顛茄新品系提高一條新途徑。主要研究結果如下:
　　1.顛茄愈傷組織誘導條件的優(yōu)化。以顛茄葉片、葉柄、莖做外植體，MS為基本培養(yǎng)基，通過比較不同激素配比對顛茄葉片、葉柄、莖的愈傷組織誘導的影響，發(fā)現(xiàn)最宜的愈傷誘導激素配比分別為:2.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1 NAA（葉片），2.0 mg·L-12，4-D（葉柄），3.0 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA（莖段），以葉片的誘導效果最好，其愈傷生長

3、旺盛，顏色鮮艷且質地緊密。
　　2.顛茄胚性愈傷的誘導。以顛茄葉片為外植體，接入UM(UMO+2.0 mg·L-12，4-D+0.25 mg·L-1 KT)培養(yǎng)基中直接誘導胚性愈傷，挑選出的胚性愈傷在附加2.0mg·L-12，4-D的MS培養(yǎng)基中繼代、純化2～3個月后，初始愈傷可轉變?yōu)闇\黃色、顆粒狀、生活力強的松脆型胚性愈傷組織，即用于懸浮培養(yǎng)系的建立。
　　3.顛茄胚性細胞懸浮系的建立和植株再生。通過正交試驗得出顛茄胚性細

4、胞懸浮培養(yǎng)的條件:培養(yǎng)基為MS+2.0 mg·L-12,4-D+0.25 mg·L-1 KT，0.5 mL接種量，200 mL三角瓶中加入50 mL培養(yǎng)基，10d繼代一次。顛茄胚性細胞經懸浮培養(yǎng)2-3個月后，可獲得生長旺盛、增殖迅速、色澤亮黃、結構致密的胚性細胞團。繼代5次以上的胚性懸浮系中體胚發(fā)生率在40.9％以上，體胚萌發(fā)率為84.36％，顛茄胚性懸浮細胞的再生植株經煉苗移栽，其成活率達95％以上。
　　4.農桿菌介導顛茄胚性

5、懸浮細胞的遺傳轉化的影響因素確定。采用單因子實驗對農桿菌菌液濃度、浸染時間、共培養(yǎng)時間和共培養(yǎng)基中AS的濃度4個因素進行研究，通過比較gus基因的瞬時表達率，確定農桿菌介導顛茄胚性懸浮細胞團的轉化條件為:工程菌C58C1-pCAM1304+-Abpmt菌液濃度OD600=0.5～0.6，浸染時間為20 min，乙酰丁香酮(AS)的最佳濃度為100μmol·L-1，共培養(yǎng)2d。
　　5.抗性愈傷組織及轉基因發(fā)根的獲得。在農桿菌介導的

6、顛茄胚性懸浮細胞的遺傳轉化中，農桿菌的抑菌選用400 mg·L-1 Carb，抗性篩選先使用10 mg·L-1 Hygr培養(yǎng)2周后，選擇壓再增加至15 mg·L-1。共獲得21個擬轉化發(fā)根系，經PCR檢測后獲得7個陽性單克隆發(fā)根系。
　　6.轉基因發(fā)根系中TAs含量的檢測。顛茄單克隆發(fā)根系中TAs含量的HPLC分析顯示:有5個轉基因顛茄發(fā)根系的東茛菪堿與莨菪堿的含量都有顯著提高，且東莨菪堿的平均增漲幅度高于莨菪堿;在最優(yōu)發(fā)根系中總