沙地云杉胚性細(xì)胞懸浮培養(yǎng)研究.pdf

1、本文以沙地云杉成熟合子胚為材料，誘導(dǎo)胚性愈傷組織，并繼代培養(yǎng)，進(jìn)而建立分散性好、活力高的懸浮細(xì)胞系。為進(jìn)行沙地云杉的原生質(zhì)體培養(yǎng)、基因?qū)爰凹?xì)胞融合等研究提供實驗基礎(chǔ)。 1、沙地云杉成熟合子胚誘導(dǎo)的愈傷組織類型有胚性與非胚性愈傷兩種。質(zhì)地松軟，表面有光澤的愈傷為胚性愈傷，其余為非胚性愈傷。愈傷組織的誘導(dǎo)率比較高，大部分誘導(dǎo)率在60％以上，但沒有添加激素的培養(yǎng)基上不產(chǎn)生愈傷。在2mg/L6—BA和1mg/L2，4—D的濃度配比下，

2、達(dá)到最高誘導(dǎo)率，為93.75％。所有胚性愈傷組織在保持和增殖時出現(xiàn)了褐化現(xiàn)象，但是程度不一樣：在不加任何激素時，愈傷組織褐化率為100％；在激素配比1mg/L6—BA和0.2mg/L2，4—D時愈傷組織褐化率最小，為16.67％；總體而言2，4—D濃度在0.1mg/L和0.2mg/L時愈傷組織褐化率小，6—BA和2，4—D一起附加時比單個附加時的愈傷組織褐化率小。同樣，2，4—D濃度在0.1mg/L和0.2mg/L時愈傷組織胚性保持的好

3、，6—BA和2，4—D一起附加時比單個附加時的愈傷組織胚性保持的好。 2、沙地云杉胚性細(xì)胞懸浮培養(yǎng)生長周期為12d，通過選擇，最佳培養(yǎng)條件是：DCR+0.1mg/L2，4—D+1.0mg/L6—BA+30g/L蔗糖，pH6.0，接種量3.0％，搖床轉(zhuǎn)速為110r/min，25±1℃、黑暗條件下震蕩培養(yǎng)。 3、動力學(xué)研究過程中，細(xì)胞鮮重和干重的變化趨勢是一致的，延遲期為第0～3d；對數(shù)生長期為4～8d；從第9d開始進(jìn)入穩(wěn)定

4、期。細(xì)胞活力的OD值第4d時達(dá)到最大，為0.74；隨后開始下降，到第10d時降到最小，為0.34；之后又有所回升。由細(xì)胞活力和干重變化曲線得出，繼代周期為6～8d。在生長周期內(nèi)，pH值一直在減小，第1～9d減小幅度比10～12d間要大。NH4+在培養(yǎng)過程中消耗最快，在第10d時已耗盡；總糖的消耗量在3～8d下降最快，NO3—和PO43—的消耗趨勢與蔗糖的基本相同，只是總糖的消耗前期與后期比NO3—和PO43—的消耗要快。NO3—的減少率

5、為63.79％，NH4+為100％，蔗糖和PO43—分別為80％和84.62％。由于缺少銨鹽，細(xì)胞生長從第9d開始進(jìn)入穩(wěn)定期。 4、細(xì)胞活力與其它各參數(shù)之間在0.05和0.01檢驗水平下都不相關(guān)；而其余的各參數(shù)之間在0.01檢驗水平下都顯著相關(guān)。細(xì)胞干重與其余的各參數(shù)之間的都呈負(fù)相關(guān)。除了細(xì)胞活力OD值外，其余個參數(shù)與細(xì)胞干重的相關(guān)系數(shù)都在—0.95以上。因此，培養(yǎng)液中不僅是總糖和其它營養(yǎng)元素直接影響細(xì)胞的增殖，培養(yǎng)液酸堿性也直