苦瓜細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系的建立.pdf

1、苦瓜的藥用成分皂甙具有降血糖、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、降低膽固醇和抗腫瘤等作用。為了通過(guò)苦瓜細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)苦瓜皂甙，本文對(duì)建立苦瓜細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系進(jìn)行研究。本文是通過(guò)愈傷組織獲得的細(xì)胞來(lái)進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，因此實(shí)驗(yàn)第一步是將苦瓜實(shí)生苗誘導(dǎo)出愈傷組織。為獲得適合液體懸浮培養(yǎng)的疏松、易碎的愈傷組織，因此將誘導(dǎo)出的愈傷組織進(jìn)一步繼代并且優(yōu)化培養(yǎng)。再?gòu)膬?yōu)化培養(yǎng)了的愈傷組織中分離出細(xì)胞，然后進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。 愈傷組織的誘導(dǎo)與繼代培養(yǎng)的優(yōu)

2、化：利用不同的激素配比，對(duì)苦瓜實(shí)生苗的各個(gè)器官進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，比較其生長(zhǎng)情況。通過(guò)實(shí)驗(yàn)得出，IAA與6-BA或KT搭配比2.4-D與6.BA或KT搭配對(duì)苦瓜愈傷組織的誘導(dǎo)及生長(zhǎng)要好。當(dāng)6-BA濃度較高(4mg/L)時(shí)，利于苦瓜愈傷組織的誘導(dǎo)。在優(yōu)化培養(yǎng)條件時(shí)，采用單因素實(shí)驗(yàn)，確定影響苦瓜愈傷組織形態(tài)及生長(zhǎng)的因素和水平，再根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)確定使苦瓜愈傷組織快速生長(zhǎng)的同時(shí)且疏松易碎。通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)得出：在MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加103.125mg

3、/L的硝酸銨，100mg/L的水解酪蛋白，蔗糖濃度為30g/L，激素濃度為6-BA0.5mg/L+0.2mg/L2.4-D時(shí)，可使苦瓜愈傷組織快速增殖。 植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)是指細(xì)胞或細(xì)胞聚集體在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，培養(yǎng)物可以在培養(yǎng)瓶中在搖床上培養(yǎng)，也可以在生物反應(yīng)器中進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)。成功的懸浮培養(yǎng)體系應(yīng)滿足3個(gè)基本條件，一是懸浮培養(yǎng)物分散性良好；二是均一性好；三是生長(zhǎng)迅速。一個(gè)良好的懸浮細(xì)胞系可以在短時(shí)間內(nèi)大量繁殖。

4、 采用單因素實(shí)驗(yàn)，先確定適合細(xì)胞生長(zhǎng)和皂甙合成的因素和水平，再采用正交實(shí)驗(yàn)，找出細(xì)胞生長(zhǎng)和皂甙合成的最適水平。得出結(jié)論：影響苦瓜細(xì)胞生長(zhǎng)的因素主次順序?yàn)锽(接種量)>D(激素配比濃度)>C(蔗糖濃度)>A(硝酸銨添加量)，其中B、D的影響非常顯著。培養(yǎng)條件即在LS2.5培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，再添加206.25mg/L的硝酸銨，30g/L的蔗糖，1.0mg/L的6-BA和0.5mg/L的IAA，接種量為4.5g/L。影響苦瓜細(xì)胞皂甙合成的因素主