黃芩細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系的建立及降低再生苗玻璃化的研究.pdf

1、利用懸浮培養(yǎng)技術(shù)可以獲得高質(zhì)量、高產(chǎn)量的黃芩替代品，具有次生代謝產(chǎn)物含量高、抗氧化活性較強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。而黃芩是我國(guó)傳統(tǒng)中藥材之一，其次生代謝產(chǎn)物黃芩苷等具有清熱燥濕、抗炎、抗病毒、抗菌和抗癌等多種病理效用，因此多年來(lái)在國(guó)際醫(yī)學(xué)界也得到廣泛應(yīng)用。本論文以黃芩實(shí)生苗為材料，誘導(dǎo)愈傷組織。在此基礎(chǔ)上，建立起黃芩細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系，通過(guò)在細(xì)胞懸浮培養(yǎng)過(guò)程中研究不同濃度誘導(dǎo)子，茉莉酸甲酯(MJ)和水楊酸(SA)對(duì)黃芩細(xì)胞懸浮培養(yǎng)不同時(shí)間的影響，并對(duì)愈傷

2、組織誘導(dǎo)的黃芩再生苗的玻璃化問(wèn)題進(jìn)行分析，為利用細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行次生代謝產(chǎn)物的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:
　　1.黃芩細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系的建立
　　以黃芩盆栽2個(gè)月的實(shí)生苗為外植體，誘導(dǎo)出了生長(zhǎng)穩(wěn)定、質(zhì)地疏松的黃芩愈傷組織，取之置于液體MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，繼代三代后獲得生長(zhǎng)穩(wěn)定的黃芩懸浮培養(yǎng)細(xì)胞團(tuán)。并測(cè)定了懸浮培養(yǎng)不同時(shí)間時(shí)黃芩細(xì)胞的抗氧化能力，以綜合隸屬度來(lái)表示抗氧化能力大小。結(jié)果表明，隨著懸浮培養(yǎng)時(shí)間的延

3、長(zhǎng)，其抗氧化能力和黃芩苷含量逐漸增加。在懸浮培養(yǎng)20天時(shí)，黃芩懸浮培養(yǎng)細(xì)胞抗氧化能力的綜合隸屬度最大，為2.69;說(shuō)明其抗氧化能力最強(qiáng)。同時(shí)，結(jié)果表明黃芩苷等黃芩次生代謝產(chǎn)物，在懸浮培養(yǎng)20天時(shí)獲得了最高的產(chǎn)量（78.31 mg/g）。
　　2.誘導(dǎo)子對(duì)黃芩懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的影響
　　為了獲得高產(chǎn)量的黃芩次生代謝產(chǎn)物，本論文研究了誘導(dǎo)子茉莉酸甲酯和水楊酸對(duì)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)、次生代謝產(chǎn)物合成及其抗氧化活性進(jìn)行了探究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，

4、添加150μmol/L茉莉酸甲酯對(duì)黃芩懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的影響最顯著，懸浮培養(yǎng)至72h，細(xì)胞生長(zhǎng)率達(dá)到967％，黃芩苷含量為184.62mg/g，其抗氧化能力也提高了很多，F(xiàn)RAP值達(dá)到了558.46，對(duì)DPPH的清除率也達(dá)到了101.51％。SA對(duì)黃芩懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞影響不是很大，12.5mg/L水楊酸處理下的細(xì)胞黃芩苷最高含量為48.05mg/g，且低于對(duì)照組;其總抗氧化能力的FRAP值分別為356.92、334.61和171.92，均低于

5、未處理樣品(FRAP453)。
　　3.降低黃芩再生苗玻璃化率及生根的研究
　　為了降低黃芩再生苗的玻璃化率并提高其生根率，本研究以黃芩愈傷組織誘導(dǎo)的再生苗為實(shí)驗(yàn)材料，分別研究了6-芐基嘌呤(6-BA)、蔗糖、瓊脂及多效唑(PP333)等組培條件對(duì)黃芩再生苗玻璃化的影響以及吲哚丁酸(IBA)對(duì)再生苗生根的影響。研究結(jié)果表明:低濃度的6-BA有利于降低不定芽的玻璃化率，當(dāng)培養(yǎng)基中添加0.2mg/L6-BA時(shí)，不定芽的玻璃化率最

6、低且增殖系數(shù)比對(duì)照增加1倍。當(dāng)培養(yǎng)基中添加25g/L蔗糖和7.5g/L瓊脂時(shí)，黃芩不定芽長(zhǎng)勢(shì)最好且玻璃化率為零，增殖系數(shù)也最高。而0.2mg/L PP333對(duì)黃芩再生苗也起到了很好的壯苗作用，再生苗明顯變得粗壯。0.1mg/L的IBA最有利于黃芩再生苗的生根，生根率為100％，平均生根數(shù)為7，移栽成活率達(dá)95％以上。
　　4.黃芩再生苗玻璃化機(jī)制的研究
　　本實(shí)驗(yàn)對(duì)黃芩再生苗玻璃化苗和正常苗進(jìn)行了形態(tài)學(xué)和生理生化特性進(jìn)行了表

7、征，研究了黃芩再生苗玻璃化的原因。與正常苗相比，黃芩玻璃化苗形態(tài)學(xué)和生理學(xué)都發(fā)生了很大變化。玻璃化苗葉片表皮細(xì)胞變大，不連續(xù)，柵欄組織和海綿組織分布混亂，細(xì)胞間隙變大;氣孔畸形，保衛(wèi)細(xì)胞腫脹。而正常苗葉片是表皮細(xì)胞由單層細(xì)胞整齊排列而成，柵欄組織棒狀，與海綿組織分布清晰。在玻璃化苗莖段解剖結(jié)構(gòu)中觀察到其表皮細(xì)胞分布間斷不連續(xù)，皮層薄壁細(xì)胞和髓細(xì)胞等大部分細(xì)胞液泡化，有的甚至已經(jīng)破碎，韌皮部和木質(zhì)部發(fā)育不完全。而正常苗中，表皮細(xì)胞是有兩層