多聚ADP-核糖聚合酶-1(PARP-1)及其相關(guān)信號(hào)通路參與豬卵泡發(fā)育及閉鎖的機(jī)制研究.pdf

1、對(duì)于哺乳動(dòng)物，卵巢中僅有少數(shù)卵泡能夠發(fā)育至成熟排卵，絕大多數(shù)卵泡的命運(yùn)是卵泡閉鎖(follicularatresia)。事實(shí)上，卵泡從早期發(fā)育直到排卵的整個(gè)過(guò)程都有卵泡閉鎖，普遍認(rèn)為卵泡閉鎖對(duì)于維持卵巢環(huán)境的穩(wěn)定具有重要意義。然而，關(guān)于卵泡早期發(fā)育以及閉鎖的調(diào)控方面雖然已有很多報(bào)道，但仍存在許多不明之處。
　　為了研究豬卵母細(xì)胞巢的裂解、原始卵泡的形成和發(fā)育特征，我們根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室之前的研究結(jié)果，選取胎兒期90（日齡）、新生1日齡及

2、出生后25、70和150（日齡）5個(gè)階段豬的卵巢組織樣，應(yīng)用蘇木素-伊紅染色(HE)方法進(jìn)行組織學(xué)研究。結(jié)果表明，母豬在胚胎90日齡時(shí)卵巢中的生殖細(xì)胞主要以卵母細(xì)胞巢(oocytenest)結(jié)構(gòu)存在，這時(shí)的卵母細(xì)胞巢正在裂解并形成原始卵泡;母豬在新生1日齡時(shí)卵巢中的生殖細(xì)胞主要以原始卵泡存在，這時(shí)在卵巢皮質(zhì)部位仍見(jiàn)卵母細(xì)胞巢(oocytenest)結(jié)構(gòu)存在，新生1天已經(jīng)有原始卵泡形成。根據(jù)HE結(jié)果統(tǒng)計(jì)出生前后各日齡階段卵母細(xì)胞巢和各級(jí)卵

3、泡的比例?？傊?，隨著豬日齡的增大，卵母細(xì)胞巢逐漸裂解并形成原始卵泡，在胚胎90日齡到新生1日齡是豬卵母細(xì)胞巢裂解和原始卵泡形成的關(guān)鍵時(shí)期，新生1日齡時(shí)豬卵巢中開(kāi)始形成初級(jí)卵泡，說(shuō)明原始卵泡的啟動(dòng)募集在新生第一天已經(jīng)開(kāi)始啟動(dòng)，到25日齡、70日齡時(shí)隨著母豬日齡的增加卵母細(xì)胞巢逐漸較少，原始卵泡和初級(jí)卵泡逐漸增多，說(shuō)明原始卵泡從新生1日齡左右到70日齡開(kāi)始募集生長(zhǎng)，這可為研究豬卵泡的啟動(dòng)募集提供參考依據(jù)。
　　即便是在動(dòng)物體內(nèi)，細(xì)胞依

4、然能夠受到各種應(yīng)激的影響，這種影響的最壞結(jié)果便是DNA鏈的損傷和斷裂。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)DNA損傷后相關(guān)蛋白會(huì)迅速會(huì)發(fā)生多聚ADP-核糖基化。多聚ADP-核糖基化是一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾作用，受多聚(ADP-核糖)聚合酶-1（PARP-1）調(diào)控，在DNA修復(fù)及細(xì)胞死亡等進(jìn)程中起至關(guān)重要的作用。最近的研究發(fā)現(xiàn)PARP-1參與多種生理與病理過(guò)程，但是它在卵泡發(fā)育及閉鎖過(guò)程中的作用仍未完全闡明。本研究旨在探討PARP-1，解離的PARP-1，ca

5、spase-3及解離的caspase-3在胎兒，新生兒和成年豬卵巢細(xì)胞中的表達(dá)模式和免疫定位。本次試驗(yàn)研究表明，在胎兒豬和新生豬中，PARP-1解離參與卵母細(xì)胞巢破裂，原始卵泡形成以及轉(zhuǎn)變?yōu)槌跫?jí)卵泡。免疫組化結(jié)果顯示PARP-1解離參與卵泡發(fā)育和閉鎖過(guò)程，這與我們之前的研究一致;然而，值得注意的是，解離的caspase-3主要定位于凋亡顆粒細(xì)胞的細(xì)胞核以及核周圍，而解離的PARP-1主要定位于凋亡顆粒細(xì)胞的細(xì)胞核中。放射免疫法(RIA)

6、的數(shù)據(jù)表明，出生后，血清中孕酮(P4)和雌二醇(E2)的濃度隨著年齡的增長(zhǎng)而增加。綜上所述，本試驗(yàn)的研究結(jié)果表明，PARP-1信號(hào)通路參與胎兒豬和新生豬卵巢中卵母細(xì)胞巢破裂和原始卵泡形成，但其機(jī)制與成年豬卵巢中細(xì)胞凋亡引發(fā)的卵泡閉鎖不同。有關(guān)PARP-1解離在豬卵泡中的作用仍需要進(jìn)一步的研究。在畜牧生產(chǎn)或醫(yī)學(xué)上，雌性哺乳動(dòng)物的卵泡在正常情況下或受到應(yīng)激的情況下卵泡都可能走向閉鎖。卵巢卵泡閉鎖是脊椎動(dòng)物的一種常見(jiàn)現(xiàn)象，卵泡閉鎖主要由顆粒細(xì)

7、胞凋亡所引起，但其具體機(jī)制仍不清楚。PARP-1是聚（ADP-核糖）聚合酶(PARP)家族的主要成員，盡管PARP-1的解離參與多種生理和病理過(guò)程，但其參與卵泡閉鎖的作用機(jī)制未見(jiàn)報(bào)道，我們從體內(nèi)和體外兩個(gè)方面證實(shí)了PARP-1的解離參與了豬卵泡閉鎖的過(guò)程。本研究結(jié)合雌二醇(E2)、孕激素(P4)的濃度以及P4/E2(P/E)比值和卵泡形態(tài)特征來(lái)確定卵泡健康狀態(tài)，將卵泡分為將健康(H)，早期閉鎖(EA)和晚期閉鎖(PA)三個(gè)階段。免疫組織

8、化學(xué)(IHC)結(jié)果表明，解離的PARP-1主要定位于閉鎖卵泡凋亡顆粒細(xì)胞的核中;而PARP-1和caspase-3主要定位于健康卵泡(H)的顆粒細(xì)胞中;免疫印跡(WB)的結(jié)果表明，與健康卵泡(H)相比，閉鎖卵泡(EA、PA)中PARP-1的表達(dá)顯著下降，而解離的caspase-3(17kDa)表達(dá)量顯著增加，同時(shí)，與健康卵泡(H)相比，閉鎖卵泡(EA、PA)中解離的PARP-1(24kDa)顯著增加，這證實(shí)了caspase-3的活化參與

9、了卵泡閉鎖過(guò)程。為了進(jìn)一步證實(shí)顆粒細(xì)胞凋亡在卵泡閉鎖過(guò)程中的作用，我們通過(guò)無(wú)血清培養(yǎng)建立了豬顆粒細(xì)胞凋亡模型。在凋亡的顆粒細(xì)胞中，PARP-1的表達(dá)顯著降低，而解離的PARP-1(24kDa)和解離的caspase-3(17kDa)顯著增加，這與體內(nèi)研究結(jié)果具有一致性，同時(shí)表明caspase-3在缺少營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的條件下被激活?？傊?，激活的caspase-3導(dǎo)致PARP-1解離，且上述過(guò)程引起了顆粒細(xì)胞的凋亡;PARP-1可能通過(guò)其解離過(guò)程

10、參與調(diào)控豬卵泡的閉鎖，由caspase-3引起的PARP-1的解離可能是調(diào)控顆粒細(xì)胞凋亡及卵泡閉鎖的分子機(jī)制，因此，我們的發(fā)現(xiàn)有助于解釋和探究卵泡發(fā)育及閉鎖的調(diào)控機(jī)制，并可能為豬育種過(guò)程中提高母豬繁殖力及抗病育種提供有價(jià)值的線索和依據(jù)。
　　與PARP-1一樣，去乙?；窼irtuins也是NAD+依賴性酶，越來(lái)越多的研究顯示這兩種酶之間在發(fā)揮其各自的酶活性是對(duì)NAD+庫(kù)的利用存在著競(jìng)爭(zhēng)，而細(xì)胞內(nèi)的NAD+庫(kù)是有限的，因此在研究P

11、ARP-1作用時(shí)，有必要研究Sirtuins的變化。Sirtuins家族中的SIRT-1（TheSilentInformationRegulator1）和SIRT-2(TheSilentInformationRegulator2)是組蛋白去乙酰化酶(HistoneDeacetylase，HDAC)第三類成員，屬于去乙?；窼irtuins家族成員，廣泛存在于動(dòng)物細(xì)胞中，在基因沉默、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、脂肪酸代謝等諸多細(xì)胞活動(dòng)中發(fā)揮作用;研究發(fā)

12、現(xiàn)SIRT-1和SIRT-2在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，然而對(duì)于他們?cè)诼雅莅l(fā)育及閉鎖過(guò)程中的作用機(jī)制還不清楚。本研究旨在探討SIRT-1和SIRT-2在胎兒，新生兒和成年豬卵巢細(xì)胞中的表達(dá)模式和免疫化學(xué)定位。本試驗(yàn)研究表明，在胎兒豬和新生豬中，SIRT-1和SIRT-2可能參與卵母細(xì)胞巢破裂和原始卵泡形成以及轉(zhuǎn)變?yōu)槌跫?jí)卵泡過(guò)程。免疫組化結(jié)果顯示SIRT-1和SIRT-2在卵泡發(fā)育和閉鎖過(guò)程中的表達(dá)與定位呈現(xiàn)一定的特征，這說(shuō)明SIRT

13、-1和SIRT-2可能參與了卵泡發(fā)育及閉鎖過(guò)程。然而，有關(guān)SIRT-1和SIRT-2在卵母細(xì)胞巢裂解、原始卵泡形成和發(fā)育以及卵泡閉鎖過(guò)程中的作用機(jī)制尚待進(jìn)一步的研究。
　　細(xì)胞內(nèi)的許多蛋白能夠受到乙酰化和去乙?；揎?，從而改變相關(guān)蛋白的活性特征，上面已經(jīng)提到去乙?；窼irtuins，目前研究較多的乙?；搁]鎖是CBP/p300。CREB（CREBbindingprotein）結(jié)合蛋白CBP/p300共激活轉(zhuǎn)錄因子家族是由兩個(gè)密切

14、相關(guān)的轉(zhuǎn)錄共激活蛋白（或共激活因子）組成，廣泛存在于動(dòng)物細(xì)胞中，在基因沉默、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、脂肪酸代謝等諸多細(xì)胞活動(dòng)中發(fā)揮作用;研究發(fā)現(xiàn)CBP/p300在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，然而對(duì)于它們?cè)诼雅莅l(fā)育及閉鎖過(guò)程中的作用機(jī)制還不清楚。本研究旨在探討CBP/p300在胎兒，新生兒和成年豬卵巢細(xì)胞中的表達(dá)模式和免疫定位。本次試驗(yàn)研究表明，在胎兒豬和新生豬中，CBP/p300可能參與卵母細(xì)胞巢破裂和原始卵泡形成以及轉(zhuǎn)變?yōu)槌跫?jí)卵泡過(guò)程。免疫組

15、化結(jié)果顯示CBP/p300在卵泡發(fā)育和閉鎖過(guò)程中的表達(dá)與定位呈現(xiàn)一定的特征，這說(shuō)明CBP/p300可能參與了卵泡發(fā)育及閉鎖過(guò)程。然而，有關(guān)CBP/p300在卵母細(xì)胞巢裂解、原始卵泡形成和發(fā)育以及卵泡閉鎖過(guò)程中的作用機(jī)制尚待進(jìn)一步的研究。
　　研究發(fā)現(xiàn)，乙?；窩BP/p300能夠?qū)M蛋白H3(histoneH3)乙?；揎?，而Sirtuins家族中的SIRT-1和SIRT-2都能夠?qū)ζ溥M(jìn)行去乙?；揎?值得注意的是，這兩種修飾之間

16、存在著動(dòng)態(tài)平衡，組蛋白在乙?；D(zhuǎn)移酶(HATs)和去乙酰化酶(HDACs)的作用下保持著動(dòng)態(tài)平衡，研究證明組蛋白的乙酰化或去乙?；揎椖軌蛴绊懙饺旧|(zhì)的轉(zhuǎn)錄活性狀態(tài)。一般來(lái)說(shuō)，組蛋白的乙?；龠M(jìn)轉(zhuǎn)錄，而去乙酰化則抑制轉(zhuǎn)錄。HistoneH3是在真核細(xì)胞中的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)中的五個(gè)主要組蛋白之一。HistoneH3的修飾包括乙?；c去乙酰化，它們分別是由組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HATs)和去乙酰化轉(zhuǎn)移酶(HDACs)所催化;已有的研究發(fā)現(xiàn)Histon

17、eH3在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，然而對(duì)于他們?cè)诼雅莅l(fā)育及閉鎖過(guò)程中的作用機(jī)制還不清楚。本研究旨在探討HistoneH3和乙酰化的HistoneH3蛋白在胎兒，新生兒和成年豬卵巢細(xì)胞中的表達(dá)模式和免疫定位。本研究表明，在胎兒豬和新生豬中，HistoneH3的乙酰化可能參與卵母細(xì)胞巢破裂和原始卵泡形成以及轉(zhuǎn)變?yōu)槌跫?jí)卵泡過(guò)程。免疫組化結(jié)果顯示HistoneH3和乙酰化的HistoneH3在卵泡發(fā)育和閉鎖過(guò)程中的表達(dá)與定位各自呈現(xiàn)一定的特