褪黑素和聚ADP-核糖聚合酶-1在大鼠記憶障礙中的作用及其相關(guān)分子機(jī)制研究.pdf

1、第一部分
　　 阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)的兩大重要的病理學(xué)特征是神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的大量神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFT)和細(xì)胞間沉積的大量老年斑(senile plaques，SP)。神經(jīng)原纖維纏結(jié)主要由異常過度磷酸化的骨架蛋白tau構(gòu)成，而老年斑的核心成分是由β-淀粉樣前體蛋白(β-amyloid precursor protein,APP)降解產(chǎn)生的β-淀

2、粉樣多肽(β-amyloid，Aβ)。目前研究認(rèn)為蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶系統(tǒng)的失衡是導(dǎo)致AD 中tau蛋白過度磷酸化的主要原因，然而對(duì)磷酸化系統(tǒng)失衡的上游調(diào)控因子尚知之甚少。有報(bào)道證明老年人褪黑素(melatonin,MT)水平下降，在AD 病人尤為明顯，我們推測(cè)老年人褪黑素水平下降可能和AD 發(fā)生有關(guān)，但是尚缺乏直接證據(jù)。我們最近發(fā)現(xiàn)褪黑素可以對(duì)抗花萼海綿誘癌素誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)絲損傷和神經(jīng)毒性作用。本實(shí)驗(yàn)中，給予褪黑素合成抑制劑——氟哌啶

3、醇，觀察對(duì)大鼠的空間記憶的影響，tau蛋白磷酸化水平，蛋白磷酸酯酶PP2A 活性改變并探討其可能機(jī)制。
　　 結(jié)果如下：(1)血清中褪黑素含量測(cè)定：為了檢測(cè)給予氟哌啶醇對(duì)大鼠褪黑素合成的抑制作用，我們采用高壓液相(HPLC)檢測(cè)大鼠血清中褪黑素的含量。結(jié)果顯示：和對(duì)照組相比，給予氟哌啶醇26小時(shí)以后，血清中褪黑素的含量明顯下降；外源性補(bǔ)充褪黑素，并未發(fā)現(xiàn)褪黑素水平顯著升高，可能和褪黑素的代謝半衰期較短有關(guān)，具體原因見討論部分。(

4、2)抑制褪黑素的生物合成對(duì)大鼠空間記憶的影響：為了檢測(cè)抑制大鼠褪黑素的生物合成對(duì)大鼠空間記憶的影響，我們采用Morris 水迷宮檢測(cè)大鼠的空間記憶。結(jié)果表明，給予氟哌啶醇后，大鼠找到平臺(tái)的潛伏期明顯變長(zhǎng)；外源性補(bǔ)充褪黑素可以部分改善大鼠的學(xué)習(xí)障礙，但不同劑量之間沒有明顯差異。(3)抑制大鼠褪黑素的生物合成對(duì)tau蛋白磷酸化的作用：為了檢測(cè)抑制大鼠褪黑素的生物合成對(duì)tau蛋白磷酸化的影響，我們發(fā)現(xiàn)給予氟哌啶醇以后，免疫印跡和免疫組化結(jié)果顯

5、示總的tau蛋白表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化，在PHF-1(Ser396/404)位點(diǎn)磷酸化水平增強(qiáng)，而非磷酸化的tau蛋白在tau-1(Ser198/199/202)位點(diǎn)的免疫反應(yīng)減弱，表明抑制大鼠的褪黑素生物合成可引起tau蛋白發(fā)生過度磷酸化。(4)抑制大鼠褪黑素的生物合成對(duì)PP2A 活性的影響：為闡明抑制大鼠褪黑素的生物合成tau蛋白發(fā)生過度磷酸化的機(jī)制，我們監(jiān)測(cè)了PP2A的活性變化。采用γ-32P 標(biāo)記的特殊底物法進(jìn)行活性分析。與對(duì)照組

6、相比，給予氟哌啶醇以后，PP2A的活性下降明顯，補(bǔ)充低劑量的褪黑素，PP2A的活性未發(fā)現(xiàn)明顯改善，高劑量組PP2A 活性則顯著性提高。(5)抑制大鼠褪黑素的生物合成對(duì)氧化應(yīng)激的影響：褪黑素作為體內(nèi)的抗氧化劑，其合成被抑制后，體內(nèi)的氧化應(yīng)激可能增強(qiáng)，氧化應(yīng)激可能影響PP2A的活性，從而影響tau蛋白的磷酸化。具體檢測(cè)結(jié)果如下：給予氟哌啶醇以后，SOD 活性顯著下降，MDA的含量增多，補(bǔ)充褪黑素以后，SOD的活性和MDA的含量可以恢復(fù)到正常

7、水平，二者之間沒有明顯差異。結(jié)論：以上結(jié)果提示：給予大鼠氟哌啶醇以后，可以抑制大鼠褪黑素的生物合成，抑制PP2A的生物活性，使大鼠的空間記憶發(fā)生障礙，tau蛋白在PHF-1 位點(diǎn)發(fā)生過度磷酸化；氧化應(yīng)激的增強(qiáng)可能是PP2A 活性下降的機(jī)制之一；外源性補(bǔ)充褪黑素，可以抑制氧化應(yīng)激，增強(qiáng)PP2A的活性，改善大鼠的空間記憶障礙，降低tau蛋白的過度磷酸化。
　　 第二部
　　 過度磷酸化的tau蛋白作為AD 兩大病理特征之一的

8、神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NFTs)的主要成分，在AD的發(fā)病過程中起重要作用。有研究表明，NFT的水平和癡呆程度正相關(guān)，而蛋白激酶(如Gsk3，cdk5，MAPK，PKA 等)和蛋白磷酸酯酶(PP1,PP2A 等)系統(tǒng)的失衡是導(dǎo)致AD 中tau蛋白過度磷酸化的主要原因。本文主要探討抑制大鼠褪黑素的生物合成以后，蛋白激酶PKA和GSK-3的活性改變，探討tau蛋白不同位點(diǎn)磷酸化的可能發(fā)生機(jī)制。用氟哌啶醇抑制褪黑素的生物合成，通過γ-P32 標(biāo)記的酶

9、的活性測(cè)定方法檢測(cè)PKA和GSK-3的活性，
　　 結(jié)果顯示：(1)抑制大鼠褪黑素的生物合成后，PKA的活性比正常水平升高1.9 倍，外源性補(bǔ)充褪黑素，可以明顯抑制氟哌啶醇引起的PKA 活性升高，同時(shí)基礎(chǔ)水平的PKA 也被抑制。抑制褪黑素生物合成時(shí)，GSK-3的活性與對(duì)照組相比下降不明顯，而外源性補(bǔ)充褪黑素可以抑制GSK-3的活性。(2)抑制大鼠褪黑素的生物合成對(duì)不同位點(diǎn)tau蛋白磷酸化的影響：抑制褪黑素的生物合成以后，tau蛋

10、白在pS214和M4位點(diǎn)發(fā)生過度磷酸化，而總的tau蛋白水平變化不明顯。(3)結(jié)論：抑制大鼠褪黑素的生物合成，可以激活PKA 引起tau蛋白在pS214和M4 位點(diǎn)發(fā)生過度磷酸化，而GSK-3 活性沒有明顯改變。直接補(bǔ)充外源性褪黑素可以同時(shí)抑制PKA和GSK-3的活性。
　　 第三部
　　 在阿爾茨海默病(Alzheimer’s Disease，AD)患者腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞骨架蛋白神經(jīng)細(xì)絲(Neurofilament，NF)發(fā)

11、生了過度磷酸化，同時(shí)褪黑素的水平下降，但二者的內(nèi)在關(guān)系不明。
　　 本部分探討了抑制大鼠褪黑素的生物合成和神經(jīng)細(xì)絲磷酸化之間的關(guān)系并探討其可能機(jī)制。
　　 結(jié)果如下：(1)抑制大鼠褪黑素的生物合成對(duì)大鼠海馬神經(jīng)細(xì)絲磷酸化的影響：抑制大鼠褪黑素的生物合成以后，我們用免疫印跡和免疫組化分別檢測(cè)了海馬神經(jīng)細(xì)絲的磷酸化情況。給予氟哌啶醇以后，與對(duì)照組相比，大鼠海馬神經(jīng)元磷酸化的神經(jīng)細(xì)絲明顯增多，非磷酸化的神經(jīng)細(xì)絲下降；外源性補(bǔ)充

12、褪黑素，則可減輕神經(jīng)細(xì)絲的磷酸化。免疫組化的結(jié)果與免疫印跡的結(jié)果相似。(2)抑制大鼠褪黑素的生物合成對(duì)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)絲磷酸化的影響：免疫組化與免疫印跡的結(jié)果顯示：給予氟哌啶醇以后，與對(duì)照組相比，大鼠海馬神經(jīng)元磷酸化的神經(jīng)細(xì)絲明顯增多，非磷酸化的神經(jīng)細(xì)絲下降；外源性補(bǔ)充褪黑素，則可減輕神經(jīng)細(xì)絲的磷酸化。(3)抑制大鼠褪黑素的生物合成對(duì)大鼠cdk-5活性的影響：結(jié)果顯示，給予氟哌啶醇以后，海馬和皮質(zhì)的cdk-5的活性比對(duì)照組升高了大約1.5

13、 倍，外源性補(bǔ)充褪黑素能逆轉(zhuǎn)cdk-5的活性。
　　 結(jié)論：抑制褪黑素的生物合成可以激活cdk-5 導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)絲的過度磷酸化，而外源性補(bǔ)充褪黑素可以抑制cdk-5的活性并抑制氟哌啶醇誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)絲過度磷酸化。第四部分 長(zhǎng)期記憶的形成需要基因表達(dá)和新的蛋白質(zhì)合成，海馬突觸可塑性則是信息存儲(chǔ)和長(zhǎng)期記憶的基礎(chǔ)。大量研究資料表明神經(jīng)元的興奮可以影響細(xì)胞的形態(tài)和功能，但是神經(jīng)元的興奮如何保持持久性，目前尚不清楚。Cohen-Armon等在

14、Aplysia上研究發(fā)現(xiàn)，PARP-1(polyADP-ribose-polymerase-1，聚ADP-核糖聚合酶-1)可參與基因的調(diào)控和長(zhǎng)期記憶的形成，然而，對(duì)PARP-1是否影響海馬依賴的記憶目前還不清楚。
　　 本研究通過給予3-Aminobenzamide(3AB)抑制PARP-1或NGF(Nervegrowth factor)激活PARP-1，觀察PARP-1對(duì)大鼠海馬參與的記憶，包括長(zhǎng)期記憶(long-term m

15、emory，LTM)和短期記憶(short-term memory，STM)的影響，探討其可能的分子機(jī)制和信號(hào)途徑。
　　 結(jié)論：(I)3AB(50 mM)可抑制大鼠PARP-1的活性，NGF則可激活PARP-1；(ii)抑制PARP-1的活性可損傷大鼠海馬依賴的長(zhǎng)期記憶和空間記憶；(iii)抑制PARP-1可降低大鼠的LTP；(iv)抑制PARP-1時(shí)，cAMP含量下降；反之cAMP含量升高，同時(shí)PKA的活性相應(yīng)發(fā)生變化；(v