多聚(ADP-核糖)聚合酶在Sepsis的表達(dá)以及亞甲藍(lán)在Sepsis中作用機(jī)制的研究.pdf

1、目的:感染性休克是一種以全身炎癥反應(yīng)為線索,細(xì)胞功能障礙,壞死為結(jié)果的休克。它可導(dǎo)致超氧陰離子及一氧化氮(NO)的產(chǎn)生增加。超氧陰離子與NO合成過(guò)亞硝酸鹽(ONOO-),過(guò)亞硝酸鹽可使細(xì)胞DNA的裂解,出現(xiàn)多聚(ADP.核糖)聚合酶[Poly(ADP-Ribose)Polymerase,PARP]的活化,PARP的活化可顯著降低其底物輔酶Ⅰ[NicotinamideAdenine Dinucleotide,NAD+]在細(xì)胞內(nèi)的濃度,減慢

2、糖酵解和電子傳遞的速度,從而減少三磷酸腺苷(ATP)的合成,這一過(guò)程將導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙和細(xì)胞死亡。
　　 多聚(ADP-核糖)聚合酶[Poly(ADP-Ribose)Polymerase,PARP]結(jié)構(gòu):多聚(ADP-核糖)聚合酶是一種蛋白修飾酶及核苷酸聚合酶,在真核生物細(xì)胞核中含量豐富。多聚(ADP-核糖)聚合酶是分子量為116KDa的蛋白質(zhì)。它的結(jié)果包括DNA結(jié)合N端區(qū),中央自我修飾區(qū)以及C端催化區(qū)。這種酶的基本結(jié)構(gòu)在真核生

3、物中具有高度的保守一致性,其中人與鼠有92％的氨基酸序列具有同源性。在不同的物種,C端催化區(qū)同樣顯示了相當(dāng)高的同源性。目前發(fā)現(xiàn)了PARP存在至少6個(gè)成員:PARP-1、PARP-2、PARP-3、PARP-4/VPARP、Tankyrase-1以及-2。最常見(jiàn)的亞型,就是,PARP-1。
　　 休克時(shí)組織細(xì)胞缺氧的監(jiān)測(cè)和及時(shí)糾正早已倍受臨床醫(yī)生重視,而且有確切證據(jù)支持通過(guò)早期積極增加全身氧輸送可以改善患者預(yù)后。但是較多的研究發(fā)現(xiàn)

4、在感染性休克晚期當(dāng)組織細(xì)胞功能已經(jīng)嚴(yán)重受損時(shí),增加全身氧輸送的治療策略難以改善患者的預(yù)后。所以我們最想知道的是掩蓋在全身血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)“正?；敝?組織和細(xì)胞到底發(fā)生了什么變化?Trzeciak和Rivers把休克上述的改變歸納為:
　　 (1)全身性組織缺氧;
　　 (2)廣泛性內(nèi)皮細(xì)胞損傷；
　　 (3)凝血系統(tǒng)活化；
　　 (4)微循環(huán)和線粒體窘迫綜合癥(mirerocirculation and

5、 mitochondrial disress syndrome,MMDS)。
　　 其中最受關(guān)注的兩個(gè)問(wèn)題,一個(gè)是以線粒體功能異常為核心細(xì)胞氧利用障礙,二、微循環(huán)功能障礙。PARP的過(guò)度活化是介導(dǎo)臟器組織損傷和器官功能障礙的一個(gè)關(guān)鍵終末效應(yīng)機(jī)制,在線粒體功能障礙的發(fā)生機(jī)制中起到中心作用。PARP無(wú)論是在早期的器官功能障礙以及SIRS(SystemicInflammatory Response Syndrome)所導(dǎo)致的多器官功能

6、衰竭中,均起著至關(guān)核心的作用。
　　 大量的文獻(xiàn)同樣支持這個(gè)觀點(diǎn):在危重病人中,PARP是一個(gè)治療干預(yù)的重要目標(biāo)。
　　 在膿毒癥及感染性休克中,亞甲藍(lán)存在如下機(jī)制:
　　 (1)亞甲藍(lán)通過(guò)可以通過(guò)抑制iNOS的活性從而減少NO的產(chǎn)生,并抑制NO發(fā)揮效應(yīng)的可溶性鳥苷酸環(huán)化酶(sGC),使環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)降低,逆轉(zhuǎn)休克時(shí)的心血管功能紊亂,避免異常釋放NO。
　　 (2)在臨床應(yīng)用上也發(fā)現(xiàn)亞甲藍(lán)在人體內(nèi)

7、可直接清除氧自由基,對(duì)組織細(xì)胞可提供多途徑的保護(hù)作用和逆轉(zhuǎn)細(xì)胞壞死的作用。NO與超氧陰離子可迅速發(fā)生反應(yīng),生成過(guò)亞硝酸鹽(ONOO-),ONOO-。進(jìn)一步酸化而發(fā)揮強(qiáng)大的氧化作用。目前已明確ONOO-病理?yè)p傷機(jī)制是與核酸作用而引起DNA的裂解,導(dǎo)致PARP的活化,PARP大量消耗NAD+,減慢電子傳遞和ATP形成的速率。PARP引起線粒體能量代謝障礙,導(dǎo)致細(xì)胞損傷甚至死亡。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已發(fā)現(xiàn)ONOO-參與介導(dǎo)了中毒性休克、缺血再灌注損傷等危

8、重病病理過(guò)程。
　　 亞甲藍(lán)的作用機(jī)制就是減少NO的合成以及超氧陰離子的含量。因此從機(jī)制上可以從源頭上,切斷這條PARP的途徑,從而達(dá)到改善組織細(xì)胞壞死的作用。
　　 本研究通過(guò)大鼠盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)復(fù)制膿毒癥模型,探討多聚(ADP-核糖)聚合酶在Sepsis的表達(dá)以及以及亞甲藍(lán)在Sepsis中作用機(jī)制的研究。
　　 目的：(1)通過(guò)研究多聚(ADP-核糖)聚合酶[Poly(ADP-Ribose)Polyme

9、rase,PARP]在Sepsis大鼠表達(dá),以闡明多聚(ADP-核糖)聚合酶在Sepsis的發(fā)生發(fā)展中所起到的作用。(2)Sepsis前應(yīng)用亞甲藍(lán),以研究亞甲藍(lán)對(duì)PARP表達(dá)及活性的影響。探討亞甲藍(lán)是否是通過(guò)干預(yù)PARP途徑,降低PARP的生成,改善組織紐胞的壞死。亞甲藍(lán)作為一種價(jià)廉、多位點(diǎn)作用的藥物,它對(duì)膿毒癥的治療有一定突破,但其確切作用機(jī)制尚需進(jìn)一步明確。
　　 方法:
　　 本研究應(yīng)用盲腸結(jié)扎穿孔法(Cecal

10、Ligation and Puncture,CLP)復(fù)制膿毒癥動(dòng)物模型,選取清潔級(jí)、健康、雄性Sprague-Drawley大鼠30只,體重200-250g(河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)實(shí)驗(yàn)分組:30只大鼠隨機(jī)分為3組,每組10只。Ⅰ組:實(shí)驗(yàn)對(duì)照組(假手術(shù)組):只開腹翻動(dòng)腸管,關(guān)腹,不結(jié)扎和穿孔盲腸,術(shù)前陰莖背靜脈注射生理鹽水0.8ml。;Ⅱ組:膿毒癥模型組:術(shù)前經(jīng)陰莖背靜脈注射生理氯化鈉溶液0.8ml,注射后進(jìn)行CLP手術(shù);Ⅲ組:亞甲藍(lán)

11、干預(yù)組:術(shù)前經(jīng)陰莖背靜脈注射10％亞甲藍(lán)(15mg/kg、平均注射劑量為0.8ml),注射后進(jìn)行CLP手術(shù)。術(shù)后18小時(shí)開腹觀察腹腔炎癥反應(yīng)情況,分別留取肺下葉、小腸腸管、腎。實(shí)驗(yàn)方法:(1)免疫組織化學(xué)法:10％多聚甲醛固定24小時(shí),脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋,連續(xù)切片3μm厚。使用SABC法免疫染色。切片分別滴加抗大鼠PARP-1抗體(1:200)4℃孵育過(guò)夜。PPS洗片后,加羊抗鼠抗體,顯色后。顯微鏡觀察,每張標(biāo)本切片取隨機(jī)取樣,

12、PARP-1免疫染色評(píng)分直接計(jì)算每個(gè)視野下陽(yáng)性細(xì)胞染色數(shù)目。(2)取每組大鼠小腸腸管,采用Western Blotting法檢測(cè)PARP-1蛋白(分子量116000)定量。
　　 采用SPSS13.0版軟件包(SPSS Company,.Chicago,Illinois,USA)應(yīng)用完全單因素方差分析對(duì)于Western blot結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,比較三組PARP-1水平,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。應(yīng)用秩轉(zhuǎn)換的非參數(shù)檢驗(yàn)對(duì)

13、于免疫組織化學(xué)法檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,比較三組PARP-1水平,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1:實(shí)驗(yàn)對(duì)照組大鼠麻醉后清醒活動(dòng)基本如常;膿毒癥組大鼠術(shù)后有嚴(yán)重的膿毒癥表現(xiàn):動(dòng)物術(shù)后蘇醒延遲,逐漸出現(xiàn)精神萎靡、豎毛、寒戰(zhàn)、呼吸急促,呼吸困難及眼角分泌物等表現(xiàn),剖腹可見(jiàn)渾濁膿血性滲液、惡臭、腸管水腫、肝腎充血水腫,而亞甲藍(lán)干預(yù)組動(dòng)物術(shù)后表現(xiàn)較輕。
　　 2:免疫組化結(jié)果:本實(shí)驗(yàn)對(duì)于三組大鼠

14、的腎臟、肺臟、小腸進(jìn)行PARP-1活性表達(dá)的監(jiān)測(cè)。我們發(fā)現(xiàn)在3個(gè)組織中,PARP-1表達(dá)比較。實(shí)驗(yàn)對(duì)照組、亞甲藍(lán)組、膿毒癥模型組通過(guò)應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)秩轉(zhuǎn)換非參數(shù)檢驗(yàn),三組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P＜0.05。進(jìn)行組組間的比較:實(shí)驗(yàn)對(duì)照組與亞甲藍(lán)組及膿毒癥模型組PARP-1表達(dá)存在明顯差異(P＜0.05)。亞甲藍(lán)干預(yù)組與膿毒癥模型組PARP-1表達(dá)存在明顯差異(P＜0.05)
　　 3:Western blot結(jié)果:PARP-1表達(dá)比較,實(shí)驗(yàn)

15、對(duì)照組、亞甲藍(lán)組、膿毒癥模型組通過(guò)應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方差分析,三組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異F291.89(P＜0.05)。進(jìn)行組組間的比較:實(shí)驗(yàn)對(duì)照組與亞甲藍(lán)組及膿毒癥模型組PARP-1表達(dá)存在明顯差異(P＜0.05)。亞甲藍(lán)干預(yù)組與膿毒癥模型組PARP-1表達(dá)存在明顯差異(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1:本實(shí)驗(yàn)采用CLP方法可成功復(fù)制腹腔感染導(dǎo)致膿毒癥大鼠動(dòng)物模型。
　　 2:通過(guò)免疫組化的方法,可檢測(cè)到膿毒癥、亞

16、甲藍(lán)組大鼠與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組相比在小腸、腎臟、肺中PARP-1陽(yáng)性表達(dá)較對(duì)照組明顯增強(qiáng)。此說(shuō)明在膿毒癥大鼠中,在關(guān)鍵臟器中PARP-1陽(yáng)性表達(dá)增強(qiáng)。此與文獻(xiàn)中研究結(jié)果相同,且在國(guó)外文獻(xiàn)的研究結(jié)果PARP.1在膿毒癥中組織損傷壞死起到關(guān)鍵中心作用。而且亞甲藍(lán)組與膿毒癥組比較,在多臟器組織標(biāo)本中,陽(yáng)性表達(dá)有所下降。此說(shuō)明亞甲藍(lán)可以降低PARP的表達(dá),達(dá)到改善多個(gè)臟器組織細(xì)胞壞死的作用。
　　 3:通過(guò)Western blot可檢測(cè)到亞甲藍(lán)