聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1在急性髓系白血病中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、本課題旨在明確AML患者骨髓標(biāo)本中PARP-1的表達(dá)情況，通過小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究其對(duì)AML疾病進(jìn)展的影響，在AML細(xì)胞系Kasumi-1和THP-1增殖和凋亡中的作用，以及通過基因芯片篩選并證實(shí)PARP-1影響的具體分子通路。本課題研究?jī)?nèi)容為AML的基礎(chǔ)研究提供新的思路，給臨床診療工作提供更多可參考利用的生物學(xué)靶點(diǎn)。
　　第一部分 PARP-1在急性髓系白血病發(fā)生發(fā)展中的作用
　　目的:
　　研究PARP-1分子在成人A

2、ML患者及正常對(duì)照者的骨髓標(biāo)本中的表達(dá)水平，分析其與臨床預(yù)后的關(guān)系;通過構(gòu)建AML模型小鼠，闡明PARP-1分子對(duì)AML疾病進(jìn)展的影響。初步明確PARP-1分子在AML中的作用，并為后續(xù)深入探討PARP-1在AML中的分子機(jī)制打下基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.標(biāo)本收集:收集成人AML患者及健康對(duì)照者的骨髓標(biāo)本并分離出骨髓單個(gè)核細(xì)胞凍存。
　　2.實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time RT-PCR)法檢測(cè)P

3、ARP-1的表達(dá)水平:采用TRIzol法提取骨髓單個(gè)核細(xì)胞總RNA，應(yīng)用PrimeScript RTreagent試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，SYBR Green法檢測(cè)AML患者及健康對(duì)照者的骨髓單個(gè)核細(xì)胞中PARP-1表達(dá)情況，分析其與臨床療效的關(guān)系。
　　3.AML模型小鼠的構(gòu)建:從ATCC購(gòu)買小鼠AML細(xì)胞系C1498,體外培養(yǎng)擴(kuò)增，然后尾靜脈注射至C57BL/6小鼠體內(nèi)。通過外周血涂片、骨髓涂片及組織切片染色鑒定模型。

4、
　　結(jié)果:
　　1.Real-time RT-PCR結(jié)果顯示，PARP-1在AML患者骨髓標(biāo)本中的表達(dá)水平顯著高于健康對(duì)照者，不同分型之間沒有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。PARP-1表達(dá)水平較高的患者治療效果差。
　　2.C1498細(xì)胞尾靜脈注射C57BL/6小鼠成功構(gòu)建小鼠AML模型。
　　發(fā)病小鼠消瘦明顯，毛發(fā)粗糙，活動(dòng)減少，體重減輕;一部分模型小鼠外周血白細(xì)胞顯著增高，另一部分明顯降低，血小板均減少，血涂片及骨髓涂片

5、可見腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn);肝臟腫大明顯，部分臟器腫瘤浸潤(rùn)形成腫塊;組織切片H&E染色可見肝、脾及腎臟內(nèi)大量的腫瘤細(xì)胞;未經(jīng)干預(yù)的模型小鼠于一月之內(nèi)因疾病進(jìn)展而死亡。
　　3.抑制PARP-1的作用能夠顯著緩解AML小鼠疾病進(jìn)展。
　　3.1 與對(duì)照組小鼠相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠消瘦減輕，毛發(fā)粗糙不明顯，活動(dòng)較正常，體重減輕情況也明顯改善。
　　3.2 實(shí)驗(yàn)組小鼠肝脾腫大程度較對(duì)照組減輕。
　　3.3 流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)外周血及肝臟中

6、C1498-GFP細(xì)胞的含量在實(shí)驗(yàn)組中均明顯降低。
　　3.4 組織切片H&E染色結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組小鼠的肝臟中C1498-GFP細(xì)胞浸潤(rùn)程度減輕。
　　3.5 實(shí)驗(yàn)組小鼠中位生存時(shí)間較對(duì)照組延長(zhǎng)，兩者分別為37.5天和23.5天。
　　結(jié)論:
　　1.PARP-1分子在AML患者骨髓標(biāo)本中高表達(dá)，相對(duì)表達(dá)水平較高的患者治療效果差，提示PARP-1可能參與AML的發(fā)生發(fā)展過程，并且在預(yù)后指導(dǎo)方面具有一定意義。

7、>　　2.通過動(dòng)物模型初步證實(shí)，抑制PARP-1的活性，明顯減輕腫瘤細(xì)胞的體內(nèi)浸潤(rùn)程度，延緩AML的疾病進(jìn)展過程，改善預(yù)后，因此干預(yù)PARP-1的活性有可能成為AML靶向治療策略之一。
　　第二部分 PARP-1對(duì)AML細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及作用機(jī)制研究
　　目的:
　　研究PARP-1抑制對(duì)AML細(xì)胞系生物學(xué)行為及相關(guān)分子通路的影響;篩選并驗(yàn)證PARP-1抑制導(dǎo)致顯著上調(diào)或下調(diào)表達(dá)的分子，分析PARP-1調(diào)節(jié)顯著的基

8、因功能和分子通路;明確下游分子在AML患者骨髓標(biāo)本中的表達(dá)，與臨床預(yù)后的關(guān)系，及對(duì)AML細(xì)胞存活及下游分子通路的影響;進(jìn)一步分析驗(yàn)證PARP-1與下游分子的相互影響。深入探討PARP-1參與AML發(fā)生發(fā)展的具體分子機(jī)制，為AML靶向治療提供新的理論基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.PARP-1抑制對(duì)AML細(xì)胞系Kasumi-1和THP-1細(xì)胞活力、周期、凋亡及相關(guān)分子通路的影響。
　　1.1 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞活力:配制不同

9、濃度梯度的PJ34溶液，分別加入Kasumi-1和THP-1細(xì)胞培養(yǎng)基中，孵育48小時(shí)，CCK8法檢測(cè)并計(jì)算細(xì)胞存活率及IC50值;用分別攜帶PARP-1干擾序列及對(duì)照序列的慢病毒感染兩種AML細(xì)胞系，驗(yàn)證干擾效率后進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，CCK8法檢測(cè)24h、48h及72h的細(xì)胞活力，對(duì)比生長(zhǎng)曲線。
　　1.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期:收集PJ34處理48h后的兩種細(xì)胞，碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色，利用流式細(xì)胞

10、儀檢測(cè)細(xì)胞周期的變化。
　　1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡:PJ34處理細(xì)胞48h，AnnexinⅤ FITC/PI雙染細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。
　　1.4 Western blot檢測(cè)周期蛋白、凋亡分子及下游通路分子的表達(dá)情況:收集處理后的細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，SDS-PAGE膠進(jìn)行凝膠電泳，western blot方法檢測(cè)PARP-1抑制對(duì)細(xì)胞周期蛋白cyclin B1、CDK1、P

11、27和細(xì)胞凋亡相關(guān)分子Bcl-2、Bcl-xL以及AKT、ERK1/2通路的影響。
　　2.篩選PARP-1下游分子及通路:應(yīng)用表達(dá)譜芯片技術(shù)篩選PARP-1抑制后顯著差異表達(dá)的分子，并初步驗(yàn)證芯片結(jié)果。利用GO富集分析法和KEGG通路分析法分析受PARP-1影響顯著的基因功能和分子通路。
　　3.研究PARP-1下游分子MPL在AML中的作用。
　　3.1 Real-time RT-PCR法:檢測(cè)上述收集的AML患者

12、及健康對(duì)照者的骨髓標(biāo)本中MPL的表達(dá)水平，并分析其與臨床療效的關(guān)系。
　　3.2 病毒感染:構(gòu)建MPL過表達(dá)及干擾病毒，分別感染Kasumi-1和THP-1細(xì)胞，western blot驗(yàn)證過表達(dá)及干擾效率。
　　3.3 CCK8實(shí)驗(yàn):正常培養(yǎng)過表達(dá)及干擾MPL分子的兩種AML細(xì)胞，CCK8法檢測(cè)細(xì)胞24h、48h及72h的細(xì)胞活力，繪制生長(zhǎng)曲線。
　　3.4 Western blot實(shí)驗(yàn):檢測(cè)干擾MPL分子對(duì)AML細(xì)

13、胞內(nèi)AKT、ERK1/2、JNK及P38MAPK通路的影響。
　　結(jié)果:
　　1.PARP-1對(duì)AML細(xì)胞活力、周期、凋亡及相關(guān)分子通路的影響。
　　1.1 PARP-1干擾抑制AML細(xì)胞活力:不同濃度梯度5、10、20、30和40μM的PJ34均能顯著抑制Kasumi-1和THP-1細(xì)胞的增殖，導(dǎo)致部分細(xì)胞死亡，且具有劑量依賴性。P J34對(duì)兩種細(xì)胞的IC50值分別為23.5±3.9μM和35.6±5.5μM。利用慢

14、病毒干擾PARP-1的表達(dá)，也顯著抑制Kasumi-1和THP-1細(xì)胞的生長(zhǎng)。
　　1.2 抑制PARP-1使細(xì)胞停滯在G2/M期:流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，PJ34處理細(xì)胞后，處于G0/G1和S期的細(xì)胞減少，而處于G2/M期的細(xì)胞顯著增多。Westernblot檢測(cè)周期蛋白顯示，PARP-1抑制下調(diào)cyclin B1和CDK1的表達(dá)水平，上調(diào)P27蛋白表達(dá)，從而使更多的細(xì)胞進(jìn)入G2/M期。
　　1.3 干擾PARP-1的作用

15、增加AML細(xì)胞凋亡:PJ34處理細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡率顯著增加，且P J34濃度越高凋亡細(xì)胞越多。Western blot檢測(cè)顯示，PJ34導(dǎo)致抗凋亡蛋白Bcl-2及Bcl-xL表達(dá)水平明顯降低。
　　2.表達(dá)譜芯片結(jié)果及分析:篩選出PARP-1抑制后顯著上調(diào)（＞2倍）表達(dá)的分子18個(gè)，和顯著下調(diào)（≤0.5倍）表達(dá)的分子9個(gè)。初步選取AML相關(guān)分子進(jìn)行real-time RT-PCR實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證芯片結(jié)果可靠。GO富集分析提示PARP-1

16、顯著影響細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、細(xì)胞分化、黏附作用、細(xì)胞遷移、血管生成、免疫應(yīng)答及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等多種生理病理過程。KEGG通路分析提示PARP-1參與TCR信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、NF-KB信號(hào)通路以及JAK/STAT信號(hào)通路等多種通路的調(diào)節(jié)。
　　3.PARP-1下游分子MPL在AML中的作用。
　　3.1 MPL在AML患者中高表達(dá)，相對(duì)表達(dá)水平較高的患者治療效果差。
　　3.2 MP

17、L促進(jìn)AML細(xì)胞增殖:慢病毒過表達(dá)和干擾兩種AML細(xì)胞中MPL的表達(dá)，蛋白水平證實(shí)了慢病毒過表達(dá)及干擾效率。培養(yǎng)感染后的細(xì)胞，CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)顯示MPL過表達(dá)組細(xì)胞增殖明顯高于對(duì)照組，而MPL干擾組的增殖顯著低于對(duì)照干擾組。
　　3.3 MPL影響AKT和ERK1/2通路:干擾MPL表達(dá)后，細(xì)胞中p-AKT/t-AKT和p-ERK/t-ERK水平降低，而p-JNK/t-JNK和p-P38/t-P38水平?jīng)]有明顯改變，說(shuō)明MPL干擾

18、后抑制了AKT及ERK1/2通路的活化，而對(duì)JNK及P38通路無(wú)顯著影響。
　　結(jié)論:
　　1.干擾PARP-1的作用能夠抑制AML細(xì)胞的增殖活力、阻礙細(xì)胞周期進(jìn)展、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，與抑制AKT和ERK1/2通路的活化有關(guān)。
　　2.PARP-1的下游分子MPL在AML患者中高表達(dá)，與不良預(yù)后相關(guān);MPL能夠促進(jìn)AML細(xì)胞增殖，激活A(yù)KT和ERK1/2信號(hào)通路。
　　3.PARP-1能影響MPL的表達(dá)，且干預(yù)MPL