分子靶向藥物17-AAG和RO3280在急性髓系白血病中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、第一部分、HSP90選擇性抑制劑17-AAG可誘導(dǎo)急性髓系白血病細(xì)胞的凋亡
　　目的：研宄熱休克蛋白90(HSP90)抑制劑17-AAG對(duì)急性髓系白血?。ˋML)細(xì)胞株的凋亡誘導(dǎo)作用及分子機(jī)制，為后續(xù)的臨床研宄提供重要依據(jù)。
　　方法：17-AAG以依次遞增的濃度處理AML細(xì)胞株HL60和NB424小時(shí)后，使用CCK-8比色法檢測(cè)細(xì)胞活性；采用Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)細(xì)胞的凋亡；采用PI

2、染色流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期。利用Western blot方法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白PARP和Caspase-3的表達(dá)和活化狀態(tài)。5^M17-AAG處理N B4細(xì)胞24小時(shí)后，利用凋亡芯片PAHS-3012檢測(cè)17-AAG處理組與DMS0對(duì)照組的370個(gè)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)變化情況。
　　結(jié)果：17-AAG可濃度依賴性地抑制HL60和NB4細(xì)胞的增殖，細(xì)胞周期試驗(yàn)表明，17-AAG加藥組細(xì)胞被阻滯于G2/M期，且隨著時(shí)間和/濃度的增加，細(xì)胞

3、周期發(fā)生紊亂。Annexin V-FITC/PI流式凋亡結(jié)果表明，隨著藥物處理濃度的增加，細(xì)胞凋亡水平增加，其中N B4細(xì)胞凋亡率:DMS0對(duì)照組6.0％±0.5%,17-AAG5^M組36.5%士2.2%，17-AAG10^M組46.9%±3.2%; HL60細(xì)胞凋亡率：DMS0對(duì)照組2.7%士0.7%,17-AAG5^M組16.7%士2.6%，17-AAG10^M組30.8%士1.6%dpM和10_處理N B4細(xì)胞24小時(shí)后，c-P

4、ARP的表達(dá)量隨著濃度的增加而增加，但未檢測(cè)到c-Caspase-3的表達(dá)。PCR Array結(jié)果表明：17-AAG處理NB4細(xì)胞后，與對(duì)照組相比，凋亡相關(guān)的370多個(gè)基因中，有56個(gè)基因顯著上調(diào)，23個(gè)基因顯著下調(diào)。
　　結(jié)論：17-AAG可抑制急性髓系白血病細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡以及阻滯周期于G2/M期。并且，這些作用是通過多種凋亡相關(guān)基因的改變共同實(shí)現(xiàn)的。
　　第二部分、腫瘤蛋白PLK1的新型分子靶向抑制劑：R03

5、280誘導(dǎo)急性髓系白血病細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制研究
　　目的：探討Polo樣激酶1(PLK1)抑制劑R03280對(duì)人類急性髓系白血病細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用及分子機(jī)制，為后續(xù)的臨床實(shí)驗(yàn)提供重要依據(jù)。
　　方法：Western Blot法檢測(cè)PLK1在白血病細(xì)胞株、AML病人和正常人骨髓中的蛋白表達(dá)，RT-PCR法檢測(cè)PLK1在105例兒童AML病人和30例非白血病病人標(biāo)本中的mRNA表達(dá)。應(yīng)用CCK-8比色法觀察不同濃度R03280

6、、Rigosertib(0N01910. Na)以及 BI2536處理A L細(xì)胞株24小時(shí)的生長(zhǎng)抑制作用，同時(shí)檢測(cè)R03280對(duì)原代細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。50nM、100nM R03280處理白血病細(xì)胞株24小時(shí)后，采用Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)細(xì)胞的凋亡，碘化丙啶染色后流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期，Hoechst33342熒光染色法觀察藥物處理前后細(xì)胞核的形態(tài)變化。Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋

7、白PARP、Caspase-3和Caspase-9的表達(dá)和活化狀態(tài)。米用SABioscience公司的凋亡芯片PAHS-3012檢測(cè)R03280處理組與DMS0組的370個(gè)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)變化情況，并驗(yàn)證候選基因的蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：Western blot結(jié)果表明：PLK1蛋白在白血病細(xì)胞株中均有較高水平的表達(dá)，在兒童AML的骨髓樣本中表達(dá)率達(dá)73.3%(11/15)，而正常骨髓標(biāo)本表達(dá)很低甚至不表達(dá)；在mRNA水平上，AM

8、L病人的PLK1表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組（106x Log2(-ACt)：82.95±110.28 vs.6.36±6.35;p<0.001)。細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)表明，R03280可劑量依賴性地抑制白血病細(xì)胞株及AML原代細(xì)胞的增殖，其在白血病細(xì)胞株中的IC50值為74nM到797nM之間，而在AML原代細(xì)胞的IC5G值在35.49-110.76nM之間；三種PLK1抑制劑分別處理白血病細(xì)胞株24小時(shí)后，檢測(cè)各組IC5a值為：NB4細(xì)胞

9、r>　　R0328013.45nM，0N01910. Na13.02nM，BI253687.65nM，K562細(xì)胞：R03280301nM，0N01910. Na1606nM，BI2536448nM，與另外兩種抑制劑相比R03280在HL60與NB4細(xì)胞中的作用最敏感。Annexin V凋亡流式結(jié)果表明，R03280處理細(xì)胞24小時(shí)后，加藥組細(xì)胞較對(duì)照組凋亡水平明顯增加，提示R03280可誘導(dǎo)白血病細(xì)胞的凋亡；細(xì)胞周期結(jié)果表明，R032

10、80可阻滯細(xì)胞在G2/M期，其中有些細(xì)胞隨濃度增加出現(xiàn)周期紊亂現(xiàn)象;Hoechst33342染色后，可觀察到R03280處理組的異常細(xì)胞核及DNA碎片；以50nM和100nM R03280處理NB4和HL60細(xì)胞24小時(shí)后，c-PARP、c-Caspase3、c-Caspase9的表達(dá)量隨著濃度的增加而增加。PCR-Array結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，
　　R03280處理NB4細(xì)胞組有32個(gè)基因明顯上調(diào)，16個(gè)基因明顯下調(diào)。其中上