MDM4S在急性髓系白血病中的表達(dá)及其在復(fù)雜核型形成中的作用.pdf

1、目的：
　　伴復(fù)雜核型急性髓系白血?。╝cutemyeloidleukemiawithcomplexkaryotype,CK-AML）大約占成人AML的10％～15%，并且隨著年齡的增長(zhǎng)，發(fā)生率增加。復(fù)雜核型是AML獨(dú)立的預(yù)后不良因素，臨床化療緩解率低，預(yù)后差，缺乏有效的化療方案。研究復(fù)雜核型形成機(jī)制有望找到有效的治療靶點(diǎn)，改善患者預(yù)后。本研究通過(guò)核型分析篩選初發(fā)急性髓系白血病伴復(fù)雜核型患者，從P53抑制因子鼠雙微體基因4（mou

2、sedoubleminute4，MDM4）及其短剪接體(shortisoformofMDM4,MDM4-S)與復(fù)雜核型形成關(guān)系入手，檢測(cè)CK-AML與正常核型AML患者M(jìn)DM4及MDM4-S的表達(dá)水平，并構(gòu)建MDM4S慢病毒載體，感染表達(dá)野生型P53的HepG2細(xì)胞株，觀(guān)察細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、P53通路相關(guān)蛋白和紡錘體檢查點(diǎn)相關(guān)蛋白表達(dá)的變化，從而在細(xì)胞和分子水平探討復(fù)雜核型形成的可能機(jī)制。
　　方法：
　　1.采用G/R顯

3、帶核型分析篩選具有復(fù)雜核型的初發(fā)AML患者
　　總結(jié)患者特征和預(yù)后，對(duì)140例初發(fā)AML患者進(jìn)行G/R顯帶核型分析，具有3種或3種以上的染色體異常者，即確定為伴有復(fù)雜核型的AML患者。
　　2.采用PCR、RT-PCR及實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)相關(guān)基因突變及MDM4FL、MDM4S的表達(dá)
　　提取140例初發(fā)AML患者骨髓樣本的DNA及總RNA，通過(guò)PCR、RT-PCR及實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法檢測(cè)TP53、FLT3-

4、ITD、AML1基因突變、MDM2、MDM4及其剪接體MDM4-S的表達(dá)水平等，分析各種相關(guān)基因的突變及MDM4-S/MDM4-FL比值的變化。
　　3.構(gòu)建MDM2、MDM4S慢病毒表達(dá)載體
　　設(shè)計(jì)含有EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)的引物，上游引物包含起始密碼子，下游引物包含終止密碼子，以K562細(xì)胞cDNA為模板，高保真酶擴(kuò)增目的基因，通過(guò)與載體雙酶切，連結(jié)，轉(zhuǎn)化感受態(tài)，挑克隆測(cè)序，將含有正確克隆的菌液搖菌提質(zhì)粒，-2

5、0℃保存?zhèn)溆?。將?gòu)建成功的各表達(dá)質(zhì)粒pCDH1-MDM2、pCDH1-MDM4S分別與包裝輔助質(zhì)粒pPACKH1-GAG，pPACKH1-REV和pVSV-G磷酸鈣共沉淀法共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝病毒顆粒，進(jìn)行滴度測(cè)定。包裝好的病毒感染HepG2細(xì)胞株，并篩選陽(yáng)性細(xì)胞株，擴(kuò)大培養(yǎng)。
　　4.細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖活性以及P53、P21、BubR1、SecurinmRNA和蛋白水平表達(dá)檢測(cè)
　　穩(wěn)定感染MDM2、MDM4S的Hep

6、G2細(xì)胞，在中期阻滯劑Nocodazole處理18小時(shí)后，收集細(xì)胞，固定，PI染色，流式細(xì)胞儀觀(guān)察細(xì)胞周期；采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況；RT-PCR及Western-blot檢測(cè)P53、P21、BubR1和Securin基因mRNA和蛋白水平表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　1.在140例初發(fā)AML患者中篩選出15例復(fù)雜核型患者
　　1.115例復(fù)雜核型患者的一般特征及預(yù)后
　　15例復(fù)雜核型患者中，男女比例為8:7

7、；年齡≥60歲7例，占46.7%；白細(xì)胞數(shù)＞100×109/L者2例，占13.3%；FAB分型：M01例，M24例，M45例，M55例；核型中，-5：2例，-7：4例，-17：2例，+21：9例；治療效果，3例經(jīng)過(guò)1次化療達(dá)到CR，1例經(jīng)過(guò)2次化療達(dá)到CR，部分緩解2例，放棄治療2例。轉(zhuǎn)歸：目前死亡13例，存活時(shí)間中位數(shù)為292天（66-738天）。
　　1.215例CK-AML患者核型分別為：
　　(1)49,XY,+13

8、,+19,+21
　　(2)52,XXX,+10,+13,+16,+21,+22
　　(3)54,XXX,+8,+11,+15,+16,-17,+19,+20,+21,+22
　　(4)47,XXY,+1,-2,-5,+12,-17,+19,+21,-22
　　(5)56,XXXY,+1,-2,+10,+11,+12,+15,+20,+21,+21,+22
　　(6)49,Y,+1,+5,-7,+8,+13

9、,+21
　　(7)50,XX,+16,+19,+20,+21
　　(8)51,XX,-7,+13,+15,+21,+21,+21,+22
　　(9)92,XXXX
　　(10)49,XY,+6,add(7)(p22),+8,add(11)(q25),+15
　　(11)49,Y,+1,+5,-7,+8,-11,+13,+22,+t(11;17)(q23;q21)
　　(12)51,XY,-7,+13

10、,+15,+16,+19,+22,+22
　　(13)48,XXY,+1,-2,-5,+12,+18
　　(14)50,XX,+1,-7,+8,+13,+15,+19
　　(15)51,XXX,+10,+13,+15,+16
　　2.初發(fā)急性髓系白血病相關(guān)基因突變及MDM4-S/MDM4-FL表達(dá)分析
　　2.1基因突變檢測(cè)結(jié)果
　　15例CK-AML患者TP53基因在DNA及RNA水平均未檢測(cè)出突變

11、，但通過(guò)FISH檢測(cè)有兩例TP53丟失一個(gè)拷貝；AML1基因各個(gè)外顯子未檢出突變；FLT3-ITD突變率在CK-AML為20%，正常核型AML為23.2%，二者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　2.2相關(guān)基因表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果
　　半定量RT-PCR檢測(cè)復(fù)雜核型組與正常核型組的兩種剪接體MDM4-S、MDM4-FL相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)復(fù)雜核型組MDM4S/MDM4FL比值和MDM4-S/MDM4-total比值均高于正常核

12、型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)MDM2、MDM4FL和MDM4S表達(dá)量，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，復(fù)雜核型組與正常核型組相比，MDM2表達(dá)水平無(wú)差異（P＞0.05），復(fù)雜核型組MDM4-FL和MDM4-S相對(duì)表達(dá)量高于正常核型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（P＜0.05）
　　3．MDM2、MDM4-S基因慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建與感染
　　通過(guò)測(cè)序鑒定，MDM2、MDM4-S序列與GeneBank

13、中序列一致，讀碼框未發(fā)生移位。包裝病毒并進(jìn)行滴度測(cè)定。包裝好的病毒感染HepG2細(xì)胞株，并篩選陽(yáng)性細(xì)胞株，擴(kuò)大培養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)中陽(yáng)性率達(dá)到了60%～80%，得到純度較高的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了目的基因的細(xì)胞。
　　4.細(xì)胞周期及細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)
　　4.1細(xì)胞周期檢測(cè)
　　Nocodazole處理18h后，空白質(zhì)粒組細(xì)胞停留在4N，即M期百分比為51.94%，其余兩組4N的百分比分別為：MDM2:33.35%;MDM4S:37.32%。與

14、空白對(duì)照組相比，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MDM2和MDM4S的兩組細(xì)胞4N細(xì)胞比值減少，即M期所占比例減少，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　4.2Nocodazole處理不同時(shí)間點(diǎn)G0/G1期細(xì)胞所占的比例
　　在Nocodazole處理0h，G0/G1期細(xì)胞所占的比例大約在40%～60%，到8h，三組細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞所占的比例明顯下降，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，三組細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞所占的比例逐漸上升，在Nocodazole處理18

15、h時(shí)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MDM2和MDM4S的兩組細(xì)胞與空白對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。說(shuō)明中期阻滯在MDM4S組降低。
　　4.3細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)
　　MTT檢測(cè)空白質(zhì)粒組、MDM2和MDM4S細(xì)胞活性，與空白對(duì)照組比較，穩(wěn)定表達(dá)MDM2與MDM4S細(xì)胞增殖活性升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　5.Real-timeRT-PCR
　　5.1穩(wěn)定表達(dá)MDM2、MDM4S組TP53mRNA相對(duì)表達(dá)量與空

16、白質(zhì)粒組相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　5.2Nocodazole處理組與對(duì)照組相比，穩(wěn)定表達(dá)MDM2、MDM4S組BubR1mRNA表達(dá)水平下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；穩(wěn)定表達(dá)MDM4S組SecurinmRNA表達(dá)水平下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Nocodazole處理空白質(zhì)粒組，SecurinmRNA表達(dá)升高，與DMSO處理組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　6.wes

17、tern-blot檢測(cè)
　　6.1P53、P21表達(dá)水平
　　穩(wěn)定表達(dá)MDM2細(xì)胞P53、P21表達(dá)水平下降，與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。穩(wěn)定表達(dá)MDM4S細(xì)胞P21蛋白表達(dá)水平降低，與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；P53蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　6.2BubR1、Securin表達(dá)水平
　　Nocodazole處理后18h后，穩(wěn)定表達(dá)MDM2和MDM4S細(xì)胞中

18、BubR1蛋白和Securin蛋白表達(dá)水平下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。空白質(zhì)粒組在Nocodazole處理后，Securin蛋白表達(dá)水平升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.復(fù)雜核型組MDM4-S相對(duì)表達(dá)量高于正常核型組。
　　2.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MDM2、MDM4-S細(xì)胞株紡錘體檢查點(diǎn)功能減弱。
　　3.提高細(xì)胞內(nèi)MDM4S/MDM4FL比值，可抑制P53通路活性。
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