PI3K-Akt抑制劑和傳統(tǒng)化療藥物對(duì)急性髓系白血病中Eps8的作用及分子機(jī)制研究.pdf

1、髓系白血病是造血系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞侵犯血液、骨髓以及其他組織的一種異質(zhì)性疾病。未經(jīng)治療的髓系白血病按照疾病發(fā)展速度分為急性髓系白血病(acutemyelocytic leukemia, AML)和慢性髓系白血病(chronic myelocytic leukemia,CML)。AML是任何一種具有自我更新能力但是不能夠發(fā)育成熟的非淋巴系統(tǒng)造血祖細(xì)胞的無(wú)限增殖，包括粒細(xì)胞系、單核/巨噬細(xì)胞系、紅細(xì)胞系以及巨核細(xì)胞系。髓系干細(xì)胞的生長(zhǎng)失調(diào)導(dǎo)致骨髓

2、抑制進(jìn)而促進(jìn)患者死亡，除非及時(shí)行化學(xué)治療緩解這一過(guò)程。AML每年發(fā)病率約為3.7/100，000，并且隨著年齡的增加而增加，＜65時(shí)的發(fā)病率為1.9/100000，然而＞65時(shí)的發(fā)病率為18.6/100000。經(jīng)過(guò)年齡調(diào)整的發(fā)病率在男性(4.6/100000)中高于女性(3.0/100000)。在過(guò)去的10年中，AML的發(fā)病率有明顯的增加。一旦患者確診AML，應(yīng)立即進(jìn)行全身評(píng)估以及開(kāi)始化學(xué)治療。除了有明確的白血病分型以外，心、肺、肝、腎

3、等全身系統(tǒng)功能的評(píng)估均應(yīng)該進(jìn)行。是否能夠獲得完全緩解(complete remission，CR)以及獲得CR的持續(xù)時(shí)間等預(yù)后相關(guān)因子應(yīng)該在開(kāi)始治療前進(jìn)行評(píng)估。CR維持的時(shí)間越長(zhǎng)患者獲得治愈的機(jī)會(huì)越大。
　　 盡管在過(guò)去的30年里AML的治療有了明顯的進(jìn)步，如新的細(xì)胞毒性藥物、不同的治療方案、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑、免疫治療、抗血管增生以及干細(xì)胞移植的應(yīng)用，仍有20％～40％的AML患者經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)治療后不能獲得CR，預(yù)后差，更甚者仍有5

4、0％～70％的獲得CR的患者會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)。一旦患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)，在現(xiàn)有的治療條件下，患者長(zhǎng)期無(wú)病生存率小于10％。白血病復(fù)發(fā)或者復(fù)燃的主要原因包括對(duì)化療藥物的耐藥以及微小殘留病灶(minimal resitdual disease，MRD)。對(duì)于AML復(fù)發(fā)或者復(fù)燃的治療仍然是白血病治療的一大難題。單一的藥物或者方案治療AML是不可能的，因此新的可能的治療方法還在繼續(xù)尋找。
　　 表皮生長(zhǎng)因子受體通路底物8(Epidermal grow

5、th factor receptor pathwaysubstrate number8，Eps8)是一種表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factorreceptor，EGFR)的酪氨酸激酶活化底物，首次由Fazioli于1993年在小鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3中發(fā)現(xiàn)。Eps8能夠被EGFR酪氨酸磷酸化，也能被其他幾種受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinases，RTKs）磷酸化。人Eps8基因位于

6、染色體12q23-q24，有p97eps8和p68eps8兩種亞型和Eps8L1-3(Eps8-related genes1-3)三種家族成員。Eps8廣泛分布于上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞以及部分血液細(xì)胞中。Scita等人，在血清饑餓的成纖維細(xì)胞中，應(yīng)用細(xì)胞膜上皮質(zhì)肌動(dòng)蛋白染色的方法，證明Eps8主要成圓狀分布在細(xì)胞核周圍的細(xì)胞質(zhì)中。
　　 Eps8具有典型的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子結(jié)構(gòu)，包括（從N端到C端）公認(rèn)的N端磷酸酪氨酸結(jié)合蛋白區(qū)域(PT

7、B)、SH3區(qū)域和C端“功能區(qū)”（圖1）。PTB結(jié)構(gòu)域是蛋白-蛋白結(jié)合區(qū)，能夠和多種磷酸酪氨酸依賴或者不依賴的多肽結(jié)合。SH3區(qū)域可以選擇性和特異性的與proline-X-X-asparate-tyrosine(PXXDY)形式的序列結(jié)合。Eps8的C端“功能區(qū)”通過(guò)激活GTPase和Rac可與F-actin直接結(jié)合，從而誘導(dǎo)Eps8定位于細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白聚集處，例如細(xì)胞膜發(fā)生皺折處。Eps8可參與多種信號(hào)通路。Eps8以Eps8-E3b

8、1-Sos1、Eps8-Abi1-p85-Sos-1和IRSp53-Eps8復(fù)合體的形式在體外被賦予Rac特異活性，并且是Rac活化誘導(dǎo)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重排過(guò)程中所必須的。同基因結(jié)構(gòu)相對(duì)應(yīng)，Eps8參與EGFR信號(hào)通路、轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及有絲分裂信號(hào)通路。同時(shí)，Disanza等人證明Eps8可以通過(guò)帽化帶倒鉤結(jié)構(gòu)末端的肌動(dòng)蛋白絲，調(diào)控肌動(dòng)蛋白導(dǎo)致的有絲分裂。也有研究證明Eps8參與非傳統(tǒng)的Wnt信號(hào)通路，進(jìn)而在脊椎動(dòng)物表達(dá)ErbB4（一種酪氨

9、酸酶受體，EGFR的一個(gè)亞家族）的神經(jīng)元祖細(xì)胞的生長(zhǎng)和有絲分裂中調(diào)控細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)。在受到EGF刺激后Eps8的過(guò)度表達(dá)能夠加速細(xì)胞的有絲分裂和轉(zhuǎn)化能力，說(shuō)明其參與RTK活化的信號(hào)通路（包括Ras/MAPK信號(hào)通路和PI3K信號(hào)通路），從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和生長(zhǎng)。
　　 近些年來(lái)，許多研究均證明Eps8在多種人腫瘤標(biāo)本及細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)，并參與腫瘤的形成、增殖和轉(zhuǎn)移:(a)Eps8在宮頸癌、胰腺癌、甲狀腺乳頭狀癌、乳腺癌腸癌、頭頸部鱗狀

10、細(xì)胞癌(HNSCC)、口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)中均過(guò)表達(dá);(b) Eps8參與腸癌、宮頸癌、胰腺癌、HNSCC以及OSCC的發(fā)生和轉(zhuǎn)移;(c)Eps8與宮頸癌、乳腺癌和甲狀腺癌患者的預(yù)后密切相關(guān)，說(shuō)明Eps8可能成為一種新型的公認(rèn)的原癌基因。因此Eps8可能在人類腫瘤的發(fā)病機(jī)理中起著重要的作用，有望成為抑制腫瘤新的治療靶點(diǎn)。
　　 Eps8在眾多的實(shí)體腫瘤中具有重要的作用，且促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、增殖以及轉(zhuǎn)移。但是目前為止，國(guó)內(nèi)外均

11、未有Eps8在AML中的作用的相關(guān)報(bào)道。在本次研究中，我們分四部分來(lái)研究Eps8在AML中的表達(dá)及作用:1.Eps8在AML患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞(bone marrow mononuclear cells， BMMNCs)中以及AML細(xì)胞系中的表達(dá)情況;2.應(yīng)用PCR芯片來(lái)研究Eps8相關(guān)基因在AML細(xì)胞系中的表達(dá)譜;3.PI3K/Akt抑制劑哌立福新對(duì)Eps8相關(guān)基因在AML細(xì)胞KG1a中表達(dá)的影響;4.傳統(tǒng)化療藥物柔紅霉素對(duì)Eps8相

12、關(guān)基因在AML細(xì)胞KG1a中表達(dá)的影響。本研究的目的是研究Eps8在AML中的表達(dá)及作用，為Eps8成為AML治療的新靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。
　　 本研究分為四個(gè)部分:
　　 第一部分Eps8在AML患者骨髓和AML細(xì)胞系中的表達(dá)
　　 目的:本部分的研究目的是探索Eps8在AML患者和細(xì)胞系中的表達(dá)。
　　 方法:21例初發(fā)AML患者和13例健康志愿者（作為對(duì)照）入選本研究。所有參與實(shí)驗(yàn)的患者和志愿者均已簽

13、署知情同意書。醫(yī)院資深的病理學(xué)家同時(shí)通過(guò)Wright-Giemsa染色、免疫組化以及免疫表型的分析再次確定患者的分型。每個(gè)參與實(shí)驗(yàn)的患者和健康志愿者，麻醉后髂脊穿刺，用含有EDTA抗凝劑的管子收集3-5ml骨髓液用于實(shí)驗(yàn)。Eps8在AML患者BMMNC中的表達(dá)用qRT-PCR檢測(cè)，在AML細(xì)胞系中的表達(dá)采用western blot的方法檢測(cè)。
　　 結(jié)果:
　　 1.1 Eps8在AML患者中的表達(dá)
　　 qRT

14、-PCR檢測(cè)的結(jié)果表明Eps8在所有的AML患者及健康志愿者中均能檢測(cè)到，但是AML患者中Eps8的表達(dá)高于健康志愿者（t=3.055，P=0.006）。進(jìn)一步探討Eps8與AML患者臨床特征之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)Eps8的表達(dá)水平跟患者的年齡、性別、WBC水平、血小板數(shù)、血紅蛋白數(shù)以及肝脾腫大無(wú)關(guān)(P＞0.05)，但是跟患者在第一次化療后是否獲得CR相關(guān)，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.021)。將AML患者分為Eps8高表達(dá)組（相對(duì)對(duì)照組Ep

15、s8表達(dá)增高≥5倍）和Eps8低表達(dá)組（相對(duì)對(duì)照組Eps8表達(dá)增高＜5倍）。結(jié)果顯示Eps8高表達(dá)組的CR率低于Eps8低表達(dá)組(P=0.024)。這些結(jié)果說(shuō)明Eps8可能能夠成為AML判斷預(yù)后的一個(gè)預(yù)測(cè)因子。
　　 1.2 Eps8在AML細(xì)胞系中的表達(dá)
　　 Western blot結(jié)果顯示Eps8在這6種細(xì)胞系中均表達(dá)，乳腺癌MCF-7細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果顯示在AML細(xì)胞株中Eps8均有表達(dá)，但是在KG1a中高表

16、達(dá)。
　　 結(jié)論:
　　 與健康志愿者相比，Eps8在AML患者中高表達(dá)（t=3.055，P=0.006），且與患者在第一次化療后是否獲得CR相關(guān)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.021)。Eps8高表達(dá)組的CR率低于Eps8低表達(dá)組（P=0.024）。Western blot檢測(cè)顯示AML細(xì)胞KG1a高表達(dá)Eps8。以上結(jié)果說(shuō)明Eps8在AML的發(fā)病機(jī)制中有重要的作用，KG1a可以成為研究Eps8在AML作用的模型。
　

17、　 第二部分AML細(xì)胞系KG1a中eps8相關(guān)的信號(hào)通路PCR芯片
　　 目的:這部分的目的是研究Eps8相關(guān)基因在AML細(xì)胞系KG1a中的表達(dá)。
　　 方法:應(yīng)用PCR芯片研究84個(gè)代表性的Eps8相關(guān)基因在KG1a細(xì)胞中的表達(dá)概況。
　　 結(jié)果:
　　 2.1 PCR芯片檢測(cè)結(jié)果中高表達(dá)和低表達(dá)的基因
　　 結(jié)果顯示有64個(gè)（包括Eps8）基因在KG1a細(xì)胞中高表達(dá)，有12個(gè)基因低表達(dá)。

18、r>　　 2.2 KG1a細(xì)胞中相關(guān)的信號(hào)通路
　　 進(jìn)一步，我們分析了高表達(dá)的基因的相關(guān)信號(hào)通路，發(fā)現(xiàn)幾乎所有高表達(dá)基因都是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)調(diào)控分子，參與PI3K/Akt信號(hào)通路、Erk1/Erk2 MAPK信號(hào)通路、IκB激酶/NFκB信號(hào)通路、JAK/STAT通路、JNK通路以及小GTPase調(diào)控的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。部分高表達(dá)基因參與細(xì)胞的生長(zhǎng)調(diào)控，包括調(diào)控細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、細(xì)胞分化、細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)以及細(xì)胞增殖。
　　

19、 結(jié)論:
　　 參與PI3K/Akt信號(hào)通路和小GTPase調(diào)控的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的基因（例如AKT1，BCL2，CASP3，PIK3CA，TP53）在KG1a細(xì)胞中高表達(dá)。
　　 第三部分PI3K/Akt抑制劑哌立福新(perifosine)對(duì)KG1a的增殖、Eps8的表達(dá)、細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞周期的影響
　　 目的:本部分的目的是探索PI3K/Akt抑制劑哌立福新對(duì)KG1a的增殖、Eps8的表達(dá)、細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞周

20、期的影響。
　　 方法:用臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)KG1a細(xì)胞的生長(zhǎng)，用SPSS軟件分析哌立福新作用的IC50。甲基纖維素克隆形成實(shí)驗(yàn)用來(lái)檢測(cè)哌立福新對(duì)KG1a克隆形成的影響。流式細(xì)胞術(shù)用來(lái)檢測(cè)哌立福新對(duì)KG1a細(xì)胞周期分布和凋亡的影響。Western blot檢測(cè)哌立福新作用后KG1a細(xì)胞中Eps8及細(xì)胞凋亡和周期調(diào)控因子(bcl-2，caspase-3，p21，cyclin E)的表達(dá)情況，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)KG1a細(xì)胞中CD34+CD

21、38-細(xì)胞的比例。
　　 結(jié)果:
　　 3.1哌立福新對(duì)KG1a細(xì)胞活性的影響
　　 結(jié)果顯示不同濃度哌立福新對(duì)KG1a細(xì)胞存活率組間有顯著差異(F=741.027，P=0.000)，哌立福新對(duì)KG1a細(xì)胞存活率不同時(shí)間(24h、48h和72h)之間有顯著差異(F=175.399，P=0.000)，哌立福新作用濃度和作用時(shí)間對(duì)KG1a細(xì)胞的存活率存在交互效應(yīng)(F=12.742，P=0.000)。各濃度哌立福新對(duì)K

22、G1a24h、48h和72h的存活率均有顯著意義（F=129.905，P=0.000; F=226.088，P=0.000;F=1033.382，P=0.000;），且隨著濃度的增加存活率較對(duì)照組降低具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。除了1.25μmol/L哌立福新作用組外(F=4.143，P=0.074)，其余濃度哌立福新作用組對(duì)KG1a不同時(shí)間之間均具有顯著差異(F=46.282，P=0.000;F=122.721, P=0.000;

23、 F=11.352, P=0.000; F=81.475, P=0.000; F=240.642, P=0.000)。哌立福新作用24h、48h和72h的IC50分別為13.28±3.63μmol/l、4.25±1.35μmol/l和3.65±0.85μmol/l。
　　 3.2哌立福新對(duì)KG1a細(xì)胞克隆形成的影響
　　 結(jié)果顯示不同濃度哌立福新對(duì)KG1a細(xì)胞克隆形成率組間有顯著差異(F=82.180，P=0.000)，

24、哌立福新對(duì)KG1a細(xì)胞克隆形成率不同時(shí)間(24h和72h)之間有顯著差異（F=55.779，P=0.000），哌立福新作用濃度和作用時(shí)間對(duì)KG1a細(xì)胞的克隆形成率存在交互效應(yīng)(F=8.008，P=0.002)。各濃度哌立福新對(duì)KG1a作用24h和72h后14天的克隆形成率均有顯著意義(F=19.960，P=0.000; F=70.748，P=0.000)，且隨著濃度的增加克隆形成率降均較對(duì)照組降低有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。各個(gè)濃度哌

25、立福新作用組對(duì)KG1a細(xì)胞14天克隆形成率不同時(shí)間之間均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.595，P=0.043;F=78.191，P=0.000; F=63.146，P=0.000)。
　　 3.3哌立福新對(duì)KG1a中Eps8表達(dá)的影響
　　 Western blot結(jié)果顯示在Eps8在KGa中的表達(dá)隨著哌立福新作用濃度及時(shí)間的增加，Eps8的條帶明顯減弱。
　　 3.4哌立福新對(duì)KG1a細(xì)胞凋亡的影響
　　 3

26、.4.1 Wright-Giemsa染色分析哌立福新對(duì)KG1a細(xì)胞形態(tài)的影響
　　 結(jié)果顯示KG1a細(xì)胞中出現(xiàn)典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)，且凋亡率隨10μmol/L哌立福新作用72h后明顯增加。
　　 3.4.2哌立福新在KG1a細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡
　　 結(jié)果顯示不同濃度哌立福新作用KG1a細(xì)胞后細(xì)胞的總凋亡、早期凋亡和晚期凋亡組間均有顯著差異(F=548.501，P=0.000;F=103.168，P=0.000; F=23

27、.608，P=0.000);哌立福新作用不同時(shí)間（24h和72h）對(duì)KG1a細(xì)胞的細(xì)胞總凋亡以及早期凋亡之間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.198，P=0.037;F=6.713，P=0.020;)，但是對(duì)細(xì)胞的晚期凋亡之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.670，P=0.215);哌立福新作用濃度和作用時(shí)間對(duì)KG1a細(xì)胞的總凋亡率、早期凋亡率以及晚期凋亡率均存在交互效應(yīng)(F=45.352, P=0.000; F=29.159, P=0.000; F=4

28、.594, P=0.017)。
　　 各濃度哌立福新對(duì)KG1a24h和72h的總凋亡率均有顯著意義(F=334.868，P=0.000; F=233.698，P=0.000)，且隨著濃度的增加總凋亡率增高(P＜0.05)。只有10μmolL和40μmol/L哌立福新作用組對(duì)KG1a的總凋亡的不同時(shí)間之間具有顯著差異(F=25.122，P=0.007;F=103.933，P=0.001)。
　　 各濃度哌立福新對(duì)KG1 a

29、24h和72h的早期凋亡率均有顯著意義(F=67.738，P=0.000;F=56.817，P=0.000），2.5μmol/L、10μmol/L、40μmol/L作用24h的早期凋亡率分別為（4.18±0.44）％、(6.09±0.35)％，(24.60±4.11)％，只有40μmol/L組跟對(duì)照組相比增加有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，作用72h后10μmol/L和40μmol/L組跟對(duì)照組相比增加有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);各濃度

30、哌立福新對(duì)KG1a24h和72h的晚期凋亡率均有顯著意義(F=7.942，P=0.000; F=19.213，P=0.000)，均較對(duì)照組增加有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。2.5μmol/L、10μmolL和40μmol/L哌立福新作用組對(duì)KG1a的早期凋亡的不同時(shí)間之間均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=10.236，P=0.033; F=67.800，P=0.001; F=23.270，P=0.008)，但是只有40μmol/L哌立福新作用組對(duì)K

31、G1a的晚期凋亡的不同時(shí)間之間均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=10.164，P=0.033)。
　　 3.4.3哌立福新對(duì)KG1a細(xì)胞中caspase-3和bcl-2的影響
　　 為了進(jìn)一步明確哌立福新誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制，采用western blot方法檢測(cè)在1.25μmol/L、2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L哌立福新作用72h后，KG1a細(xì)胞中凋亡調(diào)控因子caspase-3和

32、bcl-2的表達(dá)情況。結(jié)果顯不caspase-3和bcl-2在哌立福新處理和不處理的KG1a細(xì)胞中均有表達(dá)。隨著哌立福新作用濃度的增加，caspase-3增加，bcl-2的表達(dá)降低。這些結(jié)果說(shuō)明哌立福新能夠通過(guò)增高caspase-3和降低bcl-2來(lái)誘導(dǎo)KG1a細(xì)胞發(fā)生凋亡。
　　 3.5哌立福新對(duì)KG1a細(xì)胞周期分布的影響
　　 3.5.1哌立福新對(duì)KG1a周期分布的影響
　　 結(jié)果顯示2.5μmol/L、10

33、μmol/L、40μmol/L哌立福新作用KG1a細(xì)胞72h后，不同濃度哌立福新作用組對(duì)G0/G1、S和G2/M期之間均有顯著差異(F=741.027，P=0.000; F=380.969，P=0.000; F=42.050，P=0.000)。與對(duì)照組相比，哌立福新組細(xì)胞的G0/G1、G2/M期細(xì)胞的比例先增高后降低，S期的細(xì)胞比例先降低后升高(P＜0.05)。以上結(jié)果說(shuō)明哌立福新可以影響KG1a細(xì)胞的周期，最終將其阻滯于S期。

34、　　 3.5.2哌立福新對(duì)KG1a細(xì)胞中p21和cyclinE表達(dá)的影響
　　 為了研究細(xì)胞周期分布改變的機(jī)制，采用western blot方法檢測(cè)在2.5μmol/L、10μmol/L、40μmol/L哌立福新作用72h后，KG1a細(xì)胞中周期調(diào)控因子p21和cyclin E的表達(dá)情況。p21和cyclinE在哌立福新處理和不處理的KG1a細(xì)胞中均表達(dá)。隨著哌立福新濃度的增加， p21表達(dá)降低，cyclinE的表達(dá)增高。這些結(jié)

35、果說(shuō)明哌立福新能夠通過(guò)降低p21以及增高cyclinE的表達(dá)來(lái)影響KG1a細(xì)胞的周期分布。
　　 3.6 KG1a細(xì)胞中CD34和CD38的表達(dá)
　　 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面CD34和CD38的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)KG1a細(xì)胞中CD34+CD38-的細(xì)胞占（98.40±1.52）％。
　　 結(jié)論:
　　 哌立福新能夠劑量時(shí)間依賴性的抑制KG1a細(xì)胞的增殖、克隆形成以及Eps8的表達(dá);能夠通過(guò)增高casp

36、ase-3和降低bcl-2來(lái)誘導(dǎo)KG1a細(xì)胞發(fā)生凋亡，通過(guò)調(diào)節(jié)p21以及cyclinE的表達(dá)來(lái)影響KG1a細(xì)胞的周期分布;KG1a細(xì)胞中CD34+CD38-的細(xì)胞占(98.40±1.52)％。
　　 第四部分傳統(tǒng)化療藥物柔紅霉素(daunorubicin)對(duì)KG1a的增殖、Eps8的表達(dá)、細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞周期的影響
　　 目的:本部分的目的是探索傳統(tǒng)化療藥物柔紅霉素對(duì)KG1a的增殖、Eps8的表達(dá)、細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞周期的

37、影響。
　　 方法:用臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)KG1a細(xì)胞的生長(zhǎng)，用SPSS軟件分析柔紅霉素作用的IC50。甲基纖維素克隆形成實(shí)驗(yàn)用來(lái)檢測(cè)柔紅霉素對(duì)KG1a克隆形成的影響。流式細(xì)胞術(shù)用來(lái)檢測(cè)柔紅霉素對(duì)KG1a細(xì)胞周期分布和凋亡的影響。Western blot檢測(cè)柔紅霉素作用后KG1a細(xì)胞中Eps8及細(xì)胞凋亡和周期調(diào)控因子(bcl-2，caspase-3，p21，cyclin E)的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:
　　 4.1柔

38、紅霉素對(duì)KG1a細(xì)胞活性的影響
　　 結(jié)果顯示不同濃度柔紅霉素對(duì)KG1a細(xì)胞存活率組間有顯著差異(F=517.643，P=0.000)，柔紅霉素作用不同時(shí)間（24h、48h和72h）之間有顯著差異（F=68.968，P=0.000），柔紅霉素作用濃度和作用時(shí)間對(duì)KG1a細(xì)胞的存活率存在交互效應(yīng)(F=25.673，P=0.000)。各濃度柔紅霉素對(duì)KG1a24h、48h和72h的存活率均有顯著意義(F=88.555，P=0.000

39、; F=145.190，P=0.000; F=1052.825，P=0.000)，且隨著濃度的增加存活率降低有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。除了0.1μmol/L柔紅霉素作用組外(F=3.171，P=0.115)，其余濃度柔紅霉素作用組對(duì)KG1a不同時(shí)間之間均具有顯著差異（F=14.020，P=0.005; F=19.834，P=0.002;F=96.066，P=0.000; F=295.952，P=0.000; F=79.127，P=0

40、.000）。柔紅霉素對(duì)KG1a細(xì)胞的24h、48h和72h的IC50分別為:(0.53±0.10)μmol/L、(0.26±0.07)μmol/L和(0.19±0.04)μmol/L。
　　 4.2柔紅霉素對(duì)KG1a細(xì)胞克隆形成的影響
　　 結(jié)果顯示不同濃度柔紅霉素作用24h后的KG1a培養(yǎng)14天后，發(fā)現(xiàn)只有0.05μmol/L、0.1μmol/L、0.2μmol/L柔紅霉素作用組有克隆形成，0.4μmol/L、0.8μ

41、mol/L、1.6μmol/L組均無(wú)。0.05μmol/L、0.1μmol/L和0.2μmol/L柔紅霉素對(duì)KG1a細(xì)胞14天克隆形成率組間有顯著差異(F=1437.188，P=0.000)，柔紅霉素對(duì)KG1a細(xì)胞14天克隆形成率不同時(shí)間（24h，48h和72h）之間有顯著差異(F=24.175，P=0.000)，柔紅霉素作用濃度和作用時(shí)間對(duì)KG1a細(xì)胞的克隆形成率存在交互效應(yīng)(F=5.189，P=0.002)。各濃度柔紅霉素對(duì)KG1a

42、作用24h、48h和72h的后14天的克隆形成率均有顯著意義（F=168.525，P=0.000; F=1239.212，P=0.000; F=2698.777，P=0.000），且隨著濃度的增加克隆形成率降低具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。除了0.05μmol/L柔紅霉素作用組(F=1.998，P=0.216)外，0.1μmol/L和0.2μmol/L濃度柔紅霉素作用組對(duì)KG1a不同時(shí)間之間均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=58.899, P=0

43、.003; F=16.840, P=0.003)。
　　 4.3柔紅霉素對(duì)KG1a中Eps8表達(dá)的影響
　　 Western blot結(jié)果顯示在Eps8在KGa中的表達(dá)隨著柔紅霉素作用濃度及時(shí)間的增加，Eps8的條帶減弱。
　　 4.4柔紅霉素對(duì)KG1a細(xì)胞凋亡的影響
　　 4.4.1 Wright-Giemsa染色分析柔紅霉素對(duì)KG1a細(xì)胞形態(tài)的影響
　　 結(jié)果顯示KG1a細(xì)胞中出現(xiàn)典型的細(xì)胞凋

44、亡形態(tài)，且凋亡率隨0.8μmol/L柔紅霉素作用72h后明顯增加。
　　 4.4.2柔紅霉素在KG1a細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡
　　 結(jié)果顯示不同濃度柔紅霉素作用KG1a細(xì)胞后細(xì)胞的總凋亡、早期凋亡和晚期凋亡組間均有顯著差異(F=1002.926，P=0.000; F=520.100，P=0.000; F=611.588，P=0.000);柔紅霉素作用不同時(shí)間（24h、48h和72h）對(duì)KG1a細(xì)胞的細(xì)胞總凋亡、早期凋亡以及晚期凋亡

45、之間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3903.148，P=0.000; F=1164.274，P=0.020; F=1259.918，P=0.000);柔紅霉素作用濃度和作用時(shí)間對(duì)KG1a細(xì)胞的總凋亡率、早期凋亡率以及晚期凋亡率存在交互效應(yīng)(F=627.257，P=0.000;F=324.245, P=0.000; F=541.471, P=0.000)。
　　 各個(gè)濃度柔紅霉素對(duì)KG1a24h和72h的總凋亡率均有顯著意義(F=34.40

46、3，P=0.000; F=1280.583，P=0.000)，且隨著濃度的增加總凋亡率升高具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。0.2μmol/L、0.8μmol/L和1.6μmol/L柔紅霉素作用組對(duì)KG1a的總凋亡的不同時(shí)間之間均具有顯著差異(F=1638.280，P=0.000;F=1825.615，P=0.000; F=1002.926, P=0.000)。
　　 各濃度柔紅霉素對(duì)KG1a24h和72h的早期凋亡率均有顯著意義

47、(F=12.439，P=0.000; F=918.409，P=0.000)，且隨著濃度的增加早期凋亡率上升具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);0.2μmol/L、0.8μmol/L、1.6μmol/L柔紅霉素對(duì)KG1 a24h和72h的晚期凋亡率均有顯著意義(F=6.612，P=0.015; F=800.619，P=0.000)，各濃度柔紅霉素作用24h的晚期凋亡率分別為(10.60±1.25)％、(11.66±0.83)％、(12.48±

48、0.53)％，只有0.8μmol/L和1.6μmol/L組與對(duì)照組相比增加有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，作用72h后三組跟對(duì)照組相比均增加有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。0.2μmol/L、0.8μmol/L和1.6μmol/L柔紅霉素作用組對(duì)KG1a的早期凋亡的不同時(shí)間之間均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=25.773，P=0.007; F=451.418，P=0.000; F=2789.011，P=0.000)，對(duì)KG1a的晚期凋亡的不同時(shí)間之間

49、也均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=25.878，P=0.007; F=3018.753, P=0.000; F=149.171,P=0.000)。
　　 4.4.3柔紅霉素對(duì)KG1a細(xì)胞中caspase-3和bcl-2的影響
　　 為了進(jìn)一步明確哌立福新誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制，采用western blot方法檢測(cè)在0.05μmol/L，0.1μmol/L，0.2μmol/L，0.4μmol/L，0.8μmol/L，1.6μmol/L柔紅霉

50、素作用72h后，KG1a細(xì)胞中凋亡調(diào)控因子caspase-3和bcl-2的表達(dá)情況。結(jié)果表明caspase-3和bcl-2在柔紅霉素處理和不處理的KG1a細(xì)胞中均有表達(dá)。隨著柔紅霉素作用濃度的增加，caspase-3增加，bcl-2的表達(dá)降低。
　　 4.5柔紅霉素對(duì)KG1a細(xì)胞周期分布的影響
　　 4.5.1柔紅霉素對(duì)KG1a周期分布的影響
　　 結(jié)果顯示不同濃度柔紅霉素作用KG1a細(xì)胞后細(xì)胞的G0/G1、S和

51、G2/M期細(xì)胞的比例間均有顯著差異(F=83.353，P=0.000; F=163.987，P=0.000; F=392.806，P=0.000);柔紅霉素作用不同時(shí)間（24h和72h）對(duì)KG1a細(xì)胞的細(xì)胞G0/G1、S和G2/M期細(xì)胞的比例之間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=315.691，P=0.000; F=35.385，P=0.020; F=536.652，P=0.000）;柔紅霉素作用濃度和作用時(shí)間對(duì)KG1a細(xì)胞的G0/G1、S和G2/M

52、期細(xì)胞的比例存在交互效應(yīng)(F=57.981，P=0.000; F=163.987，P=0.000; F=86.004,P=0.000)。
　　 各濃度柔紅霉素對(duì)KG1a24h和72h的G0/G1期的細(xì)胞比例有顯著意義(F=6.081，P=0.018; F=84.500，P=0.000)，且隨濃度的增加24h時(shí)細(xì)胞的比例變化不大，但是72h時(shí)細(xì)胞比例同對(duì)照組相比減少具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。0.2μmol/L、0.8μmol

53、/L和1.6μmol/L柔紅霉素作用組對(duì)KG1a的G0/G1期細(xì)胞比例的不同時(shí)間之間均具有顯著差異（F=175.145，P=0.000;F=72.017，P=0.001;F=869.490，P=0.000）。最終柔紅霉素對(duì)KG1a細(xì)胞G0/G1期的細(xì)胞比例降低。
　　 各濃度柔紅霉素對(duì)KG1a24h和72h的S期的細(xì)胞比例有顯著意義(F=43.251，P=0.000; F=126.041，P=0.000)，且隨著濃度的增加細(xì)胞比

54、例先減少后增加，除了0.2μmol/L柔紅霉素作用24h外，均與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。0.2μmol/L、0.8μmol/L和1.6μmol/L柔紅霉素作用組對(duì)KG1a的S期細(xì)胞比例的不同時(shí)間之間均具有顯著差異（F=13.336，P=0.022; F=100.644，P=0.001;F=256.210，P=0.000）。最終柔紅霉素對(duì)KG1a細(xì)胞S期的細(xì)胞比例增加。
　　 各濃度柔紅霉素對(duì)KG1a24h和72

55、h的G2/M期的細(xì)胞比例有顯著意義(F=137.7651，P=0.000; F=270.731，P=0.000)，且隨著濃度的增加細(xì)胞比例先增加后降低，除了1.6μmol/L柔紅霉素作用24h外，均與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。0.2μmol/L、0.8μmol/L和1.6μmol/L柔紅霉素作用組對(duì)KG1a的G2/M期細(xì)胞比例的不同時(shí)間之間均具有顯著差異(F=280.308，P=0.000; F=238.568，P=0.

56、000; F=59.312，P=0.002)。最終柔紅霉素對(duì)KG1a細(xì)胞G0/G1期的細(xì)胞比例增加，但增加不如S期明顯。
　　 柔紅霉素能夠影響KG1a細(xì)胞的周期分布，將其阻滯在S期。
　　 4.5.2柔紅霉素對(duì)KG1a細(xì)胞中p21和cyclinE表達(dá)的影響
　　 為了研究細(xì)胞周期分布改變的機(jī)制，采用western blot方法檢測(cè)在0.05μmol/L，0.1μmol/L，0.2μmol/L，0.4μmol/L

57、，0.8μmol/L，1.6μmol/L柔紅霉素作用72h后，KG1a細(xì)胞中周期調(diào)控因子p21和cyclin E的表達(dá)情況。p21和cyclinE在柔紅霉素處理和不處理的KG1a細(xì)胞中均表達(dá)。隨著柔紅霉素濃度的增加，p21表達(dá)降低，cyclin E的表達(dá)增高。這些結(jié)果說(shuō)明柔紅霉素能夠通過(guò)增高p21以及cyclinE的表達(dá)來(lái)影響KG1a細(xì)胞的周期分布。
　　 結(jié)論:
　　 柔紅霉素能夠劑量時(shí)間依賴性的抑制KG1a細(xì)胞的增殖

58、、克隆形成以及Eps8的表達(dá);通過(guò)增加caspase-3和降低bcl-2來(lái)誘導(dǎo)KG1a細(xì)胞發(fā)生凋亡，通過(guò)調(diào)節(jié)p21以及cyclin E的表達(dá)來(lái)影響KG1a細(xì)胞的周期分布。
　　 結(jié)論:
　　 1.與健康志愿者相比，Eps8在AML患者中明顯高表達(dá)（t=3.055，P=0.006），且與患者在第一次化療后是否獲得CR相關(guān)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.021)。Eps8高表達(dá)組的CR率明顯低于Eps8低表達(dá)組（P=0.024）。

59、Eps8在KG1a細(xì)胞中明顯高表達(dá)。以上結(jié)果說(shuō)明Eps8在AML的發(fā)病機(jī)制中有重要的作用，KG1a可以成為研究Eps8在AML作用的模型。
　　 2.參與PI3K/Akt信號(hào)通路和小GTPase調(diào)控的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的基因（例如AKT1，BCL2，CASP3，PIK3CA，TP53）在KG1a細(xì)胞中高表達(dá)。
　　 3.哌立福新能夠劑量時(shí)間依賴性的抑制KG1a細(xì)胞的增殖、克隆形成以及降低KG1a細(xì)胞中Eps8的表達(dá);哌立福新能

60、夠通過(guò)增加caspase-3和降低bcl-2來(lái)誘導(dǎo)KG1a細(xì)胞發(fā)生凋亡。以及通過(guò)降低p21以及增加cyclinE的表達(dá)來(lái)影響KG1a細(xì)胞的周期分布。KG1a細(xì)胞中CD34+CD38-的細(xì)胞占（98.40±1.52）％。
　　 4.柔紅霉素能夠劑量時(shí)間依賴性的抑制KG1a細(xì)胞的增殖、克隆形成以及降低KG1a細(xì)胞中Eps8的表達(dá);柔紅霉素能夠通過(guò)增加caspase-3和降低bcl-2來(lái)誘導(dǎo)KG1a細(xì)胞發(fā)生凋亡。以及通過(guò)降低p21以及