熒光定量PCR檢測急性髓細胞白血病Eps8基因表達及穩(wěn)定干擾Eps8表達KG1a的建立.pdf

1、背景:
　　 急性白血病是最常見的惡性腫瘤之一，以疾病發(fā)展迅速，骨髓和（或）外周血中存在大量停留在較早期階段的原始細胞及早期幼稚細胞為特點，包括急性髓細胞白血病(AML)和急性淋巴細胞白血病(ALL)。在成人急性白血病中，又以AML最為常見。AML一旦發(fā)生，原始細胞和幼稚細胞在骨髓及其他造血器官中大量增生累積，干擾骨髓正常造血功能，導(dǎo)致致命性感染、出血和器官浸潤，自然病程僅為數(shù)周到數(shù)月。AML病因未明，一般認為與環(huán)境污染、射線、

2、藥物等因素有關(guān)。目前AML治療仍以化療為主（急性早幼粒細胞白血病除外），初始治療的標準誘導(dǎo)化療方案可以使完全緩解(Complete Remission，CR)率達60％～80％以上。然而，只有20％～30％的患者能夠獲得長期無病生存，超過50％的患者仍終將復(fù)發(fā)，一旦復(fù)發(fā)，死亡率顯著增加。急性白血病患者的5年生存率在中青年患者中只有40％，老年患者則低于10％。復(fù)發(fā)、難治和老年白血病是目前急性白血病治療的主要問題。
　　 隨著分子

3、生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和AML發(fā)病機制的逐步闡明，發(fā)現(xiàn)了一批與AML發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)的基因并研發(fā)了許多針對明確致癌基因或位點的藥物，在細胞水平上攻擊白血病細胞，如單克隆抗體，酪氨酸激酶抑制劑，法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，去甲基化藥物，組蛋白去乙酰化酶等。FLT3(Fms-like tyrosinekinase3，CD135)屬于Ⅲ型受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinaseⅢ，RTKⅢ）家族成員，研究證實FLT3的激活突變在A

4、ML的發(fā)生及疾病的進展中起重要的作用，是臨床預(yù)后差的主要指標之一。索拉非尼(Sorafenib)通過抑制具有FLT3-ITD（FLT3內(nèi)部串聯(lián)重復(fù)）突變的白血病細胞的激酶的活化，造成細胞周期停滯、凋亡，抑制細胞增殖，接受索拉非尼治療前后外周血原始細胞和骨髓原始細胞比例均下降（分別為7.5％～81％和34％～75.5％）。急性早幼粒細胞白血病(APL)是人類急性白血病分子靶向治療取得臨床治愈的成功范例。全反式維甲酸(ATRA)和三氧化二砷

5、直接靶向PML-RAR癌蛋白，誘導(dǎo)白血病細胞分化和凋亡，發(fā)揮特異性抗腫瘤作用。難治性和復(fù)發(fā)白血病的主要原因是白血病細胞對化療藥物產(chǎn)生耐受。P-gp蛋白是由多藥耐藥基因MDR1(ABCB1)編碼的依賴ATP的膜轉(zhuǎn)運蛋白。P-gp由ATP供能，使細胞內(nèi)藥物泵出細胞外，減低了細胞內(nèi)的藥物濃度使細胞產(chǎn)生耐藥性。研究顯示在AML患者中MDR1高表達與白血病耐藥相關(guān)，是預(yù)后不良的因素，通過下調(diào)MDR1表達水平來逆轉(zhuǎn)白血病耐藥是改善白血病患者預(yù)后的重

6、要策略。因此，面對急性白血病日益增高的發(fā)病率以及以分子靶向治療和分層治療的成功，闡明AML新的發(fā)病機制特別是針對急性白血病特異性分子改變進行有力的干預(yù)，對于改善治療效果十分重要。
　　 表皮生長因子受體通路底物8(Epidermal growth factor receptor pathwaysubstrate8，Eps8)是一個分子量為97KDa的蛋白，是多種酪氨酸激酶的磷酸化底物。Eps8蛋白具有典型的信號分子的結(jié)構(gòu)，從N端

7、至C端分別為磷酸化酪氨酸結(jié)合區(qū)(PTB)，SH3區(qū)和“效應(yīng)區(qū)”。研究證實Eps8磷酸化水平增加可促進細胞增殖、遷移及轉(zhuǎn)化。目前已發(fā)現(xiàn)Eps8在眾多實體腫瘤高表達，并與腫瘤侵襲及預(yù)后不良有關(guān)。在一個對205例口腔鱗狀細胞癌(OSCC)患者長達7年的隨訪中，發(fā)現(xiàn)其中186例存在Eps8持續(xù)表達，Eps8持續(xù)表達組5年總生存率為43％，而陰性組為74％，差別有統(tǒng)計學(xué)意義。在一個45例宮頸癌患者的研究中，Eps8表達水平與宮旁浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和

8、無病生存期縮短呈正相關(guān)。同時，下調(diào)Eps8水平增加宮頸癌細胞對化學(xué)藥物的敏感性。在膠質(zhì)母細胞瘤中，Eps8被證明是促進腫瘤細胞遷移和侵襲的關(guān)鍵分子，通過RNA干擾的方式沉默Eps8基因使腫瘤細胞的侵襲能力顯著下降，提示Eps8是潛在的藥物治療的靶點。然而，有關(guān)Eps8在惡性血液疾病特別是AML中的作用仍未清楚。在一個97例兒童急性淋巴細胞白血病的臨床研究中，基因芯片分析提示Eps8與無病生存率(eventfree survival，EF

9、S)相關(guān)，是預(yù)后不良的因素?；旌献V系白血病(mixedlineage leukemia, MLL)基因重排是兒童白血病中常見的基因異常改變。在許多由易位突變導(dǎo)致的兒童白血病中，含有MLL基因的染色體在MLL內(nèi)部斷裂并融合成不同的基因。其中，MLL-ABI-1(e3B1)是常見的融合基因，其形成使正常e3B1蛋白功能（抑制細胞增殖）喪失，而e3B1是Eps8的下游靶點，因此推斷Eps8可能通過MLL-ABI-1融合基因參與了MLL的發(fā)病。

10、
　　 我們假設(shè)Eps8在AML的發(fā)生發(fā)展中一樣起重要作用。在本實驗中，我們對Eps8基因進行擴增并導(dǎo)入到pMD18-T載體中構(gòu)建pMD18-T/Eps8質(zhì)粒作為熒光定量PCR檢測的標準模板，建立熒光定量PCR檢測Eps8基因的體系并檢測AML患者和健康志愿者中Eps8基因的表達水平。同時，我們應(yīng)用Western blot分析Eps8在惡性血液病細胞株的表達。最后，構(gòu)建Eps8-shRNA慢病毒載體，感染急性髓細胞白血病細胞株K

11、G1a，進一步研究Eps8在急性髓細胞白血病中的作用。
　　 目的：
　　 1、建立檢測Eps8基因的熒光定量PCR方法。
　　 2、檢測AML患者及健康志愿者中Eps8基因的表達水平并分析其臨床意義。
　　 3、分析Eps8在惡性血液疾病細胞株中的表達。
　　 4、構(gòu)建Eps8-shRNA慢病毒載體并感染急性髓細胞白血病細胞株KG1a，構(gòu)建穩(wěn)定沉默Eps8基因的急性髓細胞白血病細胞株。
　

12、　 方法:
　　 1、培養(yǎng)KG1a細胞，提取總RNA，對Eps8基因進行擴增并導(dǎo)入到pMD18-T載體中構(gòu)建pMD18-T/Eps8質(zhì)粒載體并作為熒光定量PCR檢測的標準模板，GAPDH作為內(nèi)參照。
　　 2、將定量標準模板pMD18-T/Eps8和pMD18-T/GAPDH按10倍倍比稀釋進行熒光定量PCR反應(yīng)得到標準曲線。采用SYBR Green法得到熔解曲線分析引物的特異性。將質(zhì)粒按梯度稀釋(107、106、10

13、5、104、103、102copies/μL)作為模板，分別進行熒光定量PCR擴增和常規(guī)PCR擴增，對兩者靈敏度進行比較。對同一批次提取的質(zhì)粒按梯度稀釋(107、106、105、104、103copies/μL)進行擴增，日內(nèi)重復(fù)3管，不同日期重復(fù)檢測6次分析該檢測方法的重復(fù)性。
　　 3、通過熒光定量PCR對AML患者及健康志愿者骨髓單個核細胞(BMMNCs)的cDNA進行擴增，通過標準曲線計算得到Eps8跟GAPDH基因的拷

14、貝數(shù)并分析Eps8基因的表達水平。
　　 4、Western blot分析Eps8在惡性血液病細胞株的表達。
　　 5、使用Agel和EcoRI雙酶切，將針對Eps8的DNA片段連入帶有綠色熒光蛋白和hU6啟動子的慢病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，采用脂質(zhì)體法進行轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染293T細胞，48小時后收集上清并測定病毒滴度。將慢病毒顆粒按感染復(fù)數(shù)(multiplicity ofinfection，MOI)為100感染KG1a細胞，24小時后移除

15、含病毒顆粒培養(yǎng)基，更換新鮮培養(yǎng)基，以嘌呤霉素2μg/ml篩選穩(wěn)定沉默Eps8的KG1a細胞株并通過Westernblot檢測干擾效率。
　　 結(jié)果：
　　 1、利用Trizol提取的KG1a細胞、AML患者、健康志愿者的總RNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，可見28S和18S和5S3條完整條帶，證明抽提的RNA質(zhì)量好。RT-PCR擴增后終產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳可看到與目的片段大小一致的96bp(Eps8)、143bp(GAPDH

16、)電泳條帶。重組質(zhì)粒經(jīng)基因測序證實Eps8及GAPDH基因片段成功克隆到載體中。
　　 2、pMD18-T/Eps8和pMD18-T/GAPDH標準曲線Ct值分別在19.389至35.857（102至107拷貝）循環(huán)，18.736到35.418（102至107拷貝）循環(huán)有良好的線性范圍，相關(guān)系數(shù)為分別為0.999和0.999。SYBR Green法熔解曲線均為單峰，提示擴增特異性高。日內(nèi)變異(intra-assay)系數(shù)(coe

17、fficient of variation，CV)為0.83％～1.67％，日間變異(inter-assay)系數(shù)為0.54％～3.80％，重復(fù)性好。熒光定量PCR在Eps8和GAPDH基因的拷貝數(shù)為100時可以檢測到特異的擴增曲線，而常規(guī)PCR的檢測下限為103拷貝數(shù)，該熒光定量PCR方法檢測Eps8基因的敏感性為常規(guī)PCR的10倍。
　　 3、AML患者Eps8基因表達水平顯著高于健康志愿者。
　　 4、急性髓細胞白

18、血病患者Eps8基因表達水平與白細胞、血小板、血紅蛋白計數(shù)，是否存在肝脾腫大無相關(guān)性。Eps8基因高表達組（Eps8基因表達大于或等于5倍）初次化療完全緩解率低于Eps8基因低表達組（Eps8基因表達低于5倍）。
　　 5、對5株惡性血液細胞株Eps8蛋白水平進行分析，以MCF-7（人乳腺癌細胞株）為陽性對照，Eps8在KG1a（人急性髓細胞白血病細胞株）、Raji（人淋巴瘤細胞株）、K562（人慢性粒細胞白血病細胞株）表達，在

19、HL-60（人早幼粒白血病細胞株）、8662（人多發(fā)性骨髓瘤細胞株）、健康志愿者骨髓單個核細胞不表達，表達水平分析提示Eps8在KG1a高表達。
　　 6、慢病毒包裝并能成功感染包裝293T細胞，在感染復(fù)數(shù)(multiplicity ofinfection，MOI)為100的含polybrene為5μg/ml的感染增強溶液(Enhanced InfectionSolution，ENi.S.)中，熒光顯微鏡下觀察Eps8-shRN

20、A慢病毒轉(zhuǎn)染效率達85％。Western blot檢測顯示，Eps8-shRNA慢病毒感染后KG1a細胞使Eps8蛋白表達量下降80％。
　　 結(jié)論：
　　 1、成功建立檢測Eps8基因表達的熒光定量PCR方法。
　　 2、AML患者Eps8基因表達水平顯著高于健康志愿者。
　　 3、AML患者Eps8基因高表達組（Eps8基因表達大于或等于5倍）初次化療CR率低于Eps8基因低表達組（Eps8基因表達低