鴨NOD1-MAPK1基因的克隆表達(dá)與熒光定量PCR檢測方法的建立.pdf

1、細(xì)胞因子在先天免疫中發(fā)揮著重要的作用，主要參與炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答，當(dāng)機體出現(xiàn)病變或受到外界刺激時，機體內(nèi)某些細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄水平和表達(dá)水平會發(fā)生明顯的變化。目前國內(nèi)外關(guān)于哺乳動物細(xì)胞因子的研究較多，針對禽類細(xì)胞因子的基因序列以及它們的蛋白功能研究較少。本研究克隆了鴨MAPK1和NOD1的基因序列，并建立了實時熒光定量PCR方法檢測其轉(zhuǎn)錄水平。在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)了MAPK1重組蛋白并以此為基礎(chǔ)，制備了其單克隆和多克隆抗體，為研究禽類細(xì)胞因

2、子參與先天免疫和信號通路的調(diào)控提供了技術(shù)支持。
　　1.鴨MAPK1和NOD1的克隆、表達(dá)和蛋白純化
　　本研究根據(jù)GenBank上發(fā)表的雞MAPK1和NOD1基因序列分別設(shè)計特異性引物，提取櫻桃谷鴨脾臟組織總RNA，通過RT-PCR和cDNA末端RACE技術(shù)，首次成功克隆得到鴨MAPK1和NOD1基因。對得到的基因序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明本研究通過RT-PCR和 RACE技術(shù)克隆得到的鴨MAPK1基因大小為1557 bp，基

3、因序列中56～1162 bp為其ORF區(qū)域，編碼369個氨基酸；通過RT-PCR技術(shù)克隆得到鴨NOD1基因大小為2756 bp。同源性分析結(jié)果表明鴨MAPK1編碼區(qū)的核苷酸序列與人、鼠、雞的核苷酸序列分具有85.4％、84.5%和97.3%的同源性，它們的氨基酸序列分具有96.4%、97.2%、98.6%的同源性；鴨NOD1編碼區(qū)的核苷酸序列與人、鼠、雞的核苷酸序列分具有59.2%、57.4%和88.8%的同源性，它們的氨基酸序列分具有

4、62.9%、61.1%、91.9%的同源性。
　　將鴨MAPK1基因克隆至原核表達(dá)載體pET-28a中，成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體，命名為pET-MAPK1，將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Rosetta中，經(jīng)過IPTG低溫誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)的重組蛋白經(jīng)蛋白純化柱進(jìn)行純化。SDS-PAGE的結(jié)果表明，鴨MAPK1重組蛋白在大腸桿菌Rosetta中以可溶性的方式成功表達(dá)，重組蛋白的相對分子質(zhì)量約為42 kDa。MAPK1重組蛋白成功的原核表達(dá)和

5、純化，為后續(xù)制備其單克隆抗體和多克隆抗體奠定了基礎(chǔ)。
　　2.鴨MAPK1抗體的制備
　　1）單克隆抗體的制備：為了制備抗鴨 MAPK1的單克隆抗體，利用純化的MAPK1重組蛋白與等體積的弗氏佐劑充分震蕩、乳化，每隔兩周以皮下注射方式免疫BALB/c小鼠，3次免疫后測定抗體效價。取具有高抗體效價免疫小鼠的脾臟細(xì)胞與SP/20骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，用間接ELISA方法篩選鴨MAPK1的陽性單克隆細(xì)胞株。使用有限稀釋法進(jìn)行篩選，并

6、通過3次亞克隆之后，得到能穩(wěn)定分泌單克隆的兩株雜交瘤細(xì)胞株，制備了兩株小鼠腹水單克隆抗體。采用建立的間接 ELISA法測定獲得腹水的效價，結(jié)果表明，兩株單克隆抗體的效價均達(dá)到1:12800。Western blot試驗表明兩株單克隆抗體對其抗原蛋白的結(jié)合性好、特異性強。使用單克隆抗體亞型分類試劑盒進(jìn)行亞類鑒定，結(jié)果表明兩株單克隆抗體均為IgG1型。
　　2）多克隆抗體的制備：利用純化的MAPK1重組蛋白與等體積的弗氏佐劑充分震蕩、

7、乳化，每隔兩周以皮下注射方式免疫新西蘭白兔。經(jīng)4次免疫之后，ELISA檢測其血清效價為1:25600。Western blot檢測結(jié)果表明制備的鴨MAPK1血清抗體特異性良好。
　　3.鴨MAPK1和NOD1實時熒光定量PCR檢測方法的建立和初步應(yīng)用
　　依據(jù)獲得的鴨MAPK1和NOD1基因序列設(shè)計引物，建立了鴨MAPK1和NOD1的實時熒光定量 PCR檢測方法。同時對凋亡相關(guān)堿性蛋白（Arbp）進(jìn)行引物設(shè)計用作檢測對照。以

8、鴨脾臟mRNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA作為模板，構(gòu)建質(zhì)粒用作陽性標(biāo)準(zhǔn)品，建立檢測鴨MAPK1和NOD1轉(zhuǎn)錄水平的實時熒光定量PCR檢測方法。結(jié)果顯示，建立的實時熒光定量PCR方法對鴨MAPK1和NOD1mRNA的最低檢測量分別為103和102個拷貝，在1012～103拷貝范圍內(nèi)線性關(guān)系很好，R2均大于0.996，并且該方法的特異性和重復(fù)性較好。對感染鴨疫里默氏桿菌 Yb2株櫻桃谷鴨的檢測結(jié)果表明，其脾臟中MAPK1和NOD1轉(zhuǎn)錄水平均明顯上