PI3K-Akt和Wnt信號分子在糖尿病腎病發(fā)病中的作用研究.pdf

1、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶 B（PI3K/PKB)是近年來發(fā)現(xiàn)的一個新的生長因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，PKB又名 Akt。該通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡和遷移中發(fā)揮了重要的作用，尤其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，PI3K/Akt信號通路在調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化（EMT）中發(fā)揮了重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，腎小管-間質(zhì)纖維化時同樣存在 EMT過程。腎小管-間質(zhì)纖維化是包括糖尿病腎病（DN）在內(nèi)的所有慢性腎臟疾病進(jìn)展至終末期的共同通路。已有研究表明，PI3K

2、/Akt信號通路參與了單側(cè)輸尿管梗阻大鼠和小鼠的腎間質(zhì)-纖維化過程，也有研究報道在2型糖尿?。―M）模型中，PI3K/Akt信號通路被激活，從而參與葡萄糖代謝的調(diào)節(jié)。但是有作者研究認(rèn)為在1型糖尿病時 Akt活性下調(diào)，以及高脂誘導(dǎo)的大鼠腎臟 PI3K/Ak通路活性下調(diào)。鑒于目前對 DN發(fā)病過程中 PI3K/Akt通路的表達(dá)及其意義存在爭議且對 DN時 PI3K/Akt基因和蛋白表達(dá)的動態(tài)變化研究較少，因此本課題的目的之一擬觀察 DM發(fā)生發(fā)

3、展過程中腎臟和高糖培養(yǎng)原代腎小管上皮細(xì)胞PI3K/Akt表達(dá)的變化。
　　Wnt信號通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長發(fā)育的另一個重要通路，是近來的一個研究熱點(diǎn)。Wnt信號通路有經(jīng)典Wnt/β-catenin通路、Wnt/PCP通路和Wnt/Ca2+通路三個分支，并有報道認(rèn)為 Wnt信號通路的異常激活與肝、腎、肺、心臟以及皮膚等多種組織器官纖維化和多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。在 DN發(fā)病過程中，Wnt信號通路是否參與 DN時腎小管間質(zhì)病變，目前尚

4、未見報道。因此本課題的研究目的之二為觀察 DM和高糖狀態(tài)對 Wnt經(jīng)典和非經(jīng)典通路成員 Wnt3a和Wnt5a表達(dá)的影響。
　　眾所周知，信號通路之間并非各自獨(dú)立，而是有著千絲萬縷的交叉對話關(guān)系。糖原合成酶激酶3β(GSK3β)是最早發(fā)現(xiàn)的Akt重要的下游因子之一，與許多疾病如糖尿病、癌癥有直接關(guān)系。目前的研究還認(rèn)為 GSK3β是 Wnt信號通路的重要組成部分。DN時 PI3K/Akt信號通路的變化是否會影響 Wnt通路，該影響是

5、否與它們的共同下游因子 GSK3β有關(guān)，就成為我們關(guān)心的另一個問題。因此本課題的研究目的之三為觀察PI3K特異性抑制劑LY294002預(yù)處理對高糖培養(yǎng)條件下原代大鼠腎小管上皮細(xì)胞（PTECs）PI3K-Akt-GSK3β信號通路的影響是否會影響 Wnt信號通路重要成員的β-連環(huán)蛋白（β-catenin）的表達(dá)變化，并進(jìn)而影響 Wnt信號通路的信號傳導(dǎo)。
　　研究方法：從在體和體外兩方面進(jìn)行了實驗。動物模型采用 SD大鼠鏈脲佐菌素（

6、STZ）55mg/kg一次性尾靜脈注射造成1型糖尿病模型，在 DM2w、4w、8w、12w、16w和24w各時點(diǎn)進(jìn)行動態(tài)觀察。測定動物血糖、24h尿蛋白、血肌酐和腎臟指數(shù)；HE和PAS染色光鏡觀察腎臟病理改變；免疫組織化學(xué)檢測腎組織 Akt1、Akt2、Wnt5a、GSK3β、β-catenin、TGF-β1、α-SMA和FN蛋白的表達(dá)；Western blotting檢測腎皮質(zhì) PI3Kp85α、Akt1、Akt2、p-Akt(Thr

7、308和Ser473)、Wnt3a、Wnt5a、GSK3β、p- GSK3β(Ser9)蛋白的變化；RT-PCR檢測 PI3Kp85α、Akt1、Akt2、Wnt5a、GSK3β、β-catenin、α-SMA和FN mRNA表達(dá)的變化。體外實驗用同種動物進(jìn)行 PTECs培養(yǎng)和鑒定，觀察高糖培養(yǎng)不同時點(diǎn)及 PI3K抑制劑 LY294002預(yù)處理后對 GSK3β和β-catenin蛋白和mRNA表達(dá)的影響。
　　結(jié)果顯示：生化指標(biāo)及

8、病理改變表明 DM模型復(fù)制成功，DM大鼠發(fā)生了 DN并出現(xiàn)了腎小管間質(zhì)病變；原代培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)鑒定為 PTECs。體內(nèi)實驗顯示 DM大鼠腎皮質(zhì) PI3Kp85α、Akt1、Akt2、Wnt3a、Wnt5a、GSK3β、α-SMA和FN蛋白和（或） mRNA的表達(dá)均上調(diào)，β-catenin蛋白在細(xì)胞核表達(dá)增強(qiáng)，而 mRNA表達(dá)無明顯變化。體外培養(yǎng)的PTECs上述各指標(biāo)蛋白和（或）mRNA表達(dá)顯著上調(diào)，還檢測到 p-Akt(Thr308和Se

9、r473)和p- GSK3β(Ser9)表達(dá)的上調(diào)。用 LY294002抑制 PI3K活性后，對高糖培養(yǎng)的PTECs Akt1、Akt2和GSK3β mRNA和蛋白表達(dá)無影響，下調(diào)了p-Akt(Thr308和Ser473)和p- GSK3β(Ser9)的表達(dá)，使β-catenin蛋白在細(xì)胞核中表達(dá)明顯減少。
　　以上體內(nèi)外研究結(jié)果均顯示：高糖狀態(tài)可從基因水平上調(diào) PI3K/Akt及 Wnt3a和Wnt5a表達(dá)以及激活 PI3K/A