MicroRNA-215在糖尿病腎病發(fā)病中的作用.pdf

1、研究背景和目的
　　 糖尿病腎病(DN)是糖尿病最為常見而嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥，是導(dǎo)致終末期腎病(ESRD)的重要原因，由于其發(fā)病機(jī)制尚未明確，治療仍是一大難題。腎小球系膜病變是DN最為突出的早期表現(xiàn)，系膜細(xì)胞肥大、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)異常積聚及由此導(dǎo)致的腎小球硬化是DN進(jìn)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。多年以來，國內(nèi)外醫(yī)學(xué)認(rèn)為DN的發(fā)生及發(fā)展是多種因素綜合作用的結(jié)果，但是目前臨床實(shí)踐證明，針對多種靶點(diǎn)的治療仍未能有效地遏制DN的發(fā)病及發(fā)展，因此，

2、盡快闡明其發(fā)病分子機(jī)制以及確立切實(shí)有效的治療措施，是防治DN最急需解決的一個(gè)關(guān)鍵問題。miRNA是近年來發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性、非編碼的單鏈小RNA，通過與其靶基因的3’非翻譯區(qū)(3’-UTR)堿基互補(bǔ)配對結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平直接導(dǎo)致mRNA的降解和(或)翻譯過程的抑制，負(fù)性調(diào)控靶基因蛋白的表達(dá)，在生物體的發(fā)育分化、器官形成、細(xì)胞增殖、凋亡甚至疾病的發(fā)生中發(fā)揮重要的作用，已成為近年來研究的熱點(diǎn)。目前，越來越多證據(jù)表明miRNA的異常表達(dá)與DN的

3、發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，然而其參與DN的發(fā)生機(jī)制尚不明確，有待于進(jìn)一步研究。我們前期通過基因芯片分析了2型糖尿病db/db小鼠腎臟組織miRNA表達(dá)譜，其中以腎臟特異性miRNA-miR-215的表達(dá)水平升高尤為顯著，但是它的靶基因和功能并不明確。本研究旨在通過對腎臟特異性miR-215的研究，闡明其在db/db小鼠DN發(fā)生、發(fā)展過程中的表達(dá)變化規(guī)律，通過生物信息學(xué)分析及雙熒光素酶報(bào)告確證其可能的靶基因，初步探討miR-215參與DN發(fā)生、

4、發(fā)展的機(jī)制。
　　 對象和方法
　　 一、miR-215在db/db小鼠DN發(fā)生發(fā)展過程中和高糖刺激小鼠腎小球系膜細(xì)胞(MMCs)的表達(dá)變化規(guī)律
　　 1.采用4周齡的C57BL/KsJ背景的2型糖尿病腎病動物模型db/db小鼠(實(shí)驗(yàn)組)及同周齡的db/m小鼠(對照組)作為動物實(shí)驗(yàn)對象，分別在兩組小鼠4、8、12、16周齡時(shí)，測量各組小鼠體重(BW)，留取24h尿液和血標(biāo)本，檢測24h尿白蛋白排泄量(UAE)及血

5、糖(Glu)變化；并對小鼠腎臟組織進(jìn)行PAS染色，光鏡下觀察腎臟組織的病理改變。明確db/db小鼠DN的病理進(jìn)程。
　　 2.應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(qRT-PCR)檢測不同周齡(8、12、16周齡)db/db小鼠腎臟組織及高糖(30mmol/L)刺激MMCs(6h、12h、24h、48h)后miR-215的表達(dá)變化規(guī)律。
　　 二、miR-215靶基因的預(yù)測及驗(yàn)證
　　 1.應(yīng)用在線靶基因預(yù)測軟件Target

6、Scan(http：//www.targetscan.org)；PicTar(http：//pictar.mdc-berlin.de)；microRNA.org(http：//www.microrna.org)對miR-215的靶基因進(jìn)行預(yù)測，選擇三種計(jì)算方法均能預(yù)測到的靶基因作為miR-215可能的潛在靶基因。并通過Gene Ontology(GO)注釋和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(

7、KEGG)數(shù)據(jù)庫對靶基因的生物學(xué)功能進(jìn)行分析，最后我們找出與DN相關(guān)的靶基因即連環(huán)蛋白-β互動蛋白1(CTNNBIP1)，并應(yīng)用RNA Hybrid軟件對預(yù)測的靶基因CTNNBIP1的3’-UTR與相應(yīng)的miR-215互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)的核苷酸序列的自由能進(jìn)行分析。
　　 2.應(yīng)用qRT-PCR及Western blot檢測不同周齡(8、12、16周齡)db/db小鼠腎臟組織及高糖(30mmol/L)刺激MMCs(6h、12h、24h

8、、48h)后CTNNBIP1的表達(dá)變化規(guī)律，免疫組化進(jìn)一步觀察CTNNBIP1在db/db小鼠腎臟組織的表達(dá)分布情況。
　　 3.靶基因報(bào)告質(zhì)粒的構(gòu)建及雙熒光素酶報(bào)告進(jìn)一步驗(yàn)證MMCs中miR-215對其靶基因CTNNBIP1的直接調(diào)控作用。
　　 4、應(yīng)用gain-and loss-of-function的設(shè)計(jì)理念，利用miR-215 mimic和miR-215inhibitor轉(zhuǎn)染MMCs，從正反兩個(gè)方面證明miR-

9、215對CTNNBIP1的表達(dá)和其下游關(guān)鍵信號分子β-catenin活性的調(diào)控作用。
　　 結(jié)果
　　 一、db/db小鼠BW、Glu和UAE的動態(tài)變化
　　 4周齡時(shí)，db/db小鼠BW較db/m小鼠增加(P<0.05)，但Glu及UAE均無明顯差異。8周齡時(shí)，db/db小鼠BW、Glu和UAE均明顯增加(均P<0.05)，提示8周齡時(shí)db/db小鼠已發(fā)生DN，尚處于DN早期。此后，隨著周齡的增長，db/db小

10、鼠BW、Glu及UAE逐漸升高(均P<0.05)，這些結(jié)果提示，db/db小鼠隨著Glu的升高，DN不斷進(jìn)展。
　　 二、db/db小鼠腎臟病理動態(tài)改變
　　 不同周齡db/m小鼠腎臟組織均無明顯改變。db/db小鼠在4周齡時(shí)腎臟組織未見異常改變；8周齡時(shí)腎臟組織出現(xiàn)腎小球肥大；12周齡時(shí)腎小球系膜細(xì)胞顯著增生；16周齡出現(xiàn)腎小球系膜基質(zhì)大量積聚和K-W結(jié)節(jié)等典型的DN病理改變。結(jié)果進(jìn)一步提示，db/db小鼠隨著周齡的增

11、加，DN不斷進(jìn)展。
　　 三、db/db小鼠腎臟組織及高糖刺激MMCs miR-215表達(dá)的動態(tài)變化
　　 與同周齡的db/m小鼠比較，在小鼠8、12、16周時(shí)，db/db小鼠腎臟組織miR-215的表達(dá)均顯著增高(均P<0.05)；并且，隨著周齡的增加，miR-215在db/db小鼠腎臟組織的表達(dá)逐漸上升，呈明顯的時(shí)間依賴性(均P<0.05)；同時(shí)，miR-215的表達(dá)隨高糖刺激MMCs時(shí)間的延長進(jìn)行性升高，其表達(dá)量在

12、刺激細(xì)胞48 h時(shí)達(dá)到高峰(均P<0.05)。提示：miR-215在DN環(huán)境下表達(dá)明顯上調(diào)，其表達(dá)量隨時(shí)間進(jìn)展而進(jìn)行性升高。這些結(jié)果說明，miR-215參與了DN的發(fā)病過程。
　　 四、miR-215靶基因預(yù)測分析
　　 應(yīng)用在線靶基因預(yù)測軟件Targetscan，PicTar和miRanda對miR-215的靶基因進(jìn)行預(yù)測，先找出三個(gè)軟件中預(yù)測到的miR-215的靶基因的交集，其中共篩選出8個(gè)靶基因，包括：Alcam，

13、Blcap，Bhlhe22，Ctnnbip1，Cdc6，Pkp4，Wnk1，Msn；通過GO注釋和KEGG數(shù)據(jù)庫從這8個(gè)預(yù)測靶基因中找出miR-215最可能調(diào)控的與DN相關(guān)的靶基因?yàn)镃TNNBIP1。生物信息學(xué)分析表明：CTNNBIP1是一種新發(fā)現(xiàn)的β-catenin結(jié)合蛋白，它可以與Tcf/Lef轉(zhuǎn)錄因子競爭性地與β-catenin結(jié)合，從而負(fù)性調(diào)控Wnt/β-catenin信號途徑。并且，通過RNA Hybrid軟件預(yù)測，在CTNN

14、BIP1的3’-UTR區(qū)有一個(gè)與miR-215部分互補(bǔ)的位點(diǎn)，其結(jié)合的最小自由能是-17.3kcal/mol，提示：這一位點(diǎn)對于miR-215而言具有可接近及結(jié)合性。這些結(jié)果提示，CTNNBIP1可能是與DN相關(guān)的miR-215的靶基因。
　　 五、db/db小鼠腎臟組織及高糖刺激MMCs CTNNBIP1表達(dá)的動態(tài)變化
　　 與同周齡db/m小鼠比較，在小鼠8、12、16周時(shí)，db/db小鼠腎臟組織CTNNBIP1的m

15、RNA表達(dá)量均顯著降低(均P<0.05)，并且，隨著周齡的增加，db/db小鼠CTNNBIP1 mRNA的表達(dá)呈進(jìn)行性下調(diào)的趨勢(均P<0.05)，而db/m小鼠則無明顯變化。db/db小鼠腎臟組織CTNNBIP1蛋白表達(dá)改變與mRNA表達(dá)變化一致，8、12、16周db/db小鼠腎臟組織CTNNBIP1的蛋白表達(dá)量較同周齡的db/m小鼠表達(dá)均下調(diào)(均P<0.05)。并且，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)CTNNBIP1主要表達(dá)于腎小球系膜區(qū)，12周db/

16、db小鼠腎小球系膜區(qū)陽性染色較同周齡的db/m小鼠顯著減少，CTNNBIP1蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)。提示：隨著周齡的增加，DN的進(jìn)展，db/db小鼠腎臟組織CTNNBIP1的表達(dá)量進(jìn)行性降低；同時(shí)，CTNNBIP1 mRNA和蛋白的表達(dá)量隨高糖刺激MMCs時(shí)間的延長呈進(jìn)行性降低的趨勢，提示：miR-215的表達(dá)量與CTNNBIP1的表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)。這些結(jié)果說明，miR-215可能在DN進(jìn)展過程中調(diào)控CTNNBIP1的表達(dá)。

17、
　　 六、雙熒光素酶報(bào)告證實(shí)miR-215對CTNNBIP1的直接調(diào)控
　　 成功構(gòu)建CTNNBIP1 mRNA3’-UTR熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒(pMIR-CTNNBIP1-3'UTR)，以轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒(pMIR-REPORT載體)的MMCs為對照組，以海腎熒光素酶活性為內(nèi)參，將螢火蟲熒光活性與海腎熒光活性的比值表示相對熒光素酶活性。轉(zhuǎn)染miR-215 mimic與重組載體pMIR-CTNNBIP1-3'UTR的細(xì)胞熒光素酶

18、表達(dá)強(qiáng)度相對于對照組顯著降低(P<0.05)，說明miR-215能夠直接作用于CTNNBIP1的3’-UTR，抑制重組載體熒光活性的表達(dá)。這些結(jié)果提示，CTNNBIP1是miR-215的靶基因。
　　 七、miR-215 mimic/inhibitor轉(zhuǎn)染MMCs后CTNNBIP1表達(dá)和β-catenin活性變化
　　 為了證實(shí)miR-215對MMCs CTNNBIP1/β-catenin通路的調(diào)控作用，細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-

19、215 mimic/inhibitor48h后觀察CTNNBIP1 mRNA和蛋白表達(dá)變化，并分析其下游信號通路關(guān)鍵分子β-catenin的活性改變。與對照組比較，轉(zhuǎn)染miR-215 mimic過表達(dá)MMCs miR-215明顯降低CTNNBIP1 mRNA和蛋白的表達(dá)量，β-catenin的表達(dá)活性顯著增強(qiáng)(均P<0.05)；而轉(zhuǎn)染miR-215 inhibitor抑制MMCs miR-215表達(dá)后，CTNNBIP1的mRNA和蛋白表

20、達(dá)水平顯著增加，β-catenin的活性明顯降低(均P<0.05)。這些結(jié)果提示，miR-215可能通過調(diào)控CTNNBIP1/β-catenin通路參與DN的發(fā)病過程。
　　 八、miR-215對MMCs增殖活性的影響
　　 為了進(jìn)一步明確miR-215能否影響MMCs的增殖活性，我們轉(zhuǎn)染miR-215mimic/inhibitor上調(diào)或者沉默內(nèi)源性miR-215的表達(dá)后，應(yīng)用MTT法檢測MMCs的增殖活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與

21、對照組比較，過表達(dá)miR-215可明顯增加細(xì)胞的增殖活性，然而，下調(diào)MMCs miR-215的表達(dá)后，細(xì)胞的增殖活性顯著降低(均P<0.05)。這些結(jié)果提示，miR-215可能通過調(diào)控CTNNBIP1/β-catenin通路影響MMCs的增殖活性，從而介導(dǎo)了DN的發(fā)生發(fā)展。
　　 結(jié)論
　　 一、miR-215在db/db小鼠腎臟組織和高糖刺激的MMCs中均顯著升高，呈明顯的時(shí)間依賴性，初步在整體動物和細(xì)胞水平證實(shí)miR

22、-215參與了DN的發(fā)病過程。
　　 二、應(yīng)用在線靶基因預(yù)測軟件預(yù)測及雙熒光素酶報(bào)告進(jìn)一步證實(shí)CTNNBIP1是miR-215的靶基因。生物信息學(xué)分析表明：CTNNBIP1是一種新發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性Wnt/β-catenin信號通路的負(fù)性調(diào)控分子。
　　 三、db/db小鼠腎臟組織CTNNBIP1的mRNA和蛋白表達(dá)明顯減少，其表達(dá)量隨DN的進(jìn)展而進(jìn)行性降低，miR-215的表達(dá)量與CTNNBIP1的表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)。過表達(dá)