黏附分子CD146在糖尿病腎病發(fā)病中作用的研究.pdf

1、目的：通過體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）的方法研究黏附分子CD146在高糖刺激的血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)情況，以探討CD146與糖尿病腎病中的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的關(guān)系，觀察高糖刺激下HUVECs表達(dá)的TGF-β1與CD146的關(guān)系，明確CD146與TGF-β1的關(guān)系，探討CD146在DKD發(fā)病過程中的可能作用機制。 方法：體外傳代培養(yǎng)HUVECs，免疫熒光技術(shù)定位CD146在HUVECs上的表達(dá)，流式細(xì)胞儀檢測胞膜CD146

2、的表達(dá)量；分別于24h、48h、72h收集細(xì)胞，RT-PCR方法半定量檢測不同時相下正常血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的CD146 mRNA變化。根據(jù)1640培養(yǎng)液中含右旋葡萄糖（D-glucose）的濃度分成4組：NG組、15mM組、30mM組、45mM組，培養(yǎng)72h后收集各組細(xì)胞，RT-PCR半定量檢測各組CD146、TGF-β1mRNA表達(dá)量，western bolt方法檢測CD146蛋白水平表達(dá)變化，ELISA方法檢測TGF-β1胞外蛋白表達(dá)

3、。將定量CD146單抗加入培養(yǎng)72h HUVECs（NG及30mM組）培養(yǎng)液中至終濃度為30ug/mL，共孵育24h，RT-PCR、ELISA分別檢測TGF-β1 mRNA及胞外蛋白表達(dá)。 結(jié)果：⑴正常HUVECs上檢測到CD146蛋白表達(dá)，以胞膜及細(xì)胞間連接處明顯，mRNA表達(dá)隨培養(yǎng)時間延長表達(dá)逐漸增加，但無顯著性差異。⑵高糖刺激HUVECs 72h，CD146 mRNA隨糖濃度升高表達(dá)增加，至30mmol/L時最強，而繼續(xù)升

4、高糖濃度至45mmol/L時，CD146 mRNA水平則下降；western blot提示其蛋白表達(dá)亦呈現(xiàn)類似表達(dá)趨勢。⑶同等高糖刺激72h HUVECs，表達(dá)的TGF-β1 mRNA及蛋白隨糖濃度升高均持續(xù)增強，30mmol/L時開始與NG組有顯著差異，45mmol/L時呈現(xiàn)更顯著的增高趨勢。⑷CD146單抗與培養(yǎng)72h HUVECs（NG、30mM組）共孵育發(fā)現(xiàn)，30mM組HUVECs表達(dá)的TGF-β1 mRNA及蛋白水平較對照組明

5、顯增強，而NG組無明顯改變。 結(jié)論：①CD146合成于HUVECs胞內(nèi)，表達(dá)于胞膜，表達(dá)量隨細(xì)胞間聯(lián)系建立而增加，與培養(yǎng)時間無顯著關(guān)聯(lián)。②高糖刺激HUVECs早期（72h），即可檢測到CD146呈現(xiàn)濃度相關(guān)性表達(dá)增強，且較正常組高，提示CD146可能與DKD的發(fā)生過程密切相關(guān)。③同等高糖刺激條件下培養(yǎng)72h的 HUVECs表達(dá)的TGF-β1 mRNA及蛋白均持續(xù)增高，與CD146的表達(dá)呈現(xiàn)一定相關(guān)性。CD146單抗干預(yù)后，高糖組