1型多聚ADP核糖合成酶與轉(zhuǎn)錄因子相互作用調(diào)控心血管系統(tǒng)基因轉(zhuǎn)錄的機(jī)制研究.pdf

1、心血管系統(tǒng)相關(guān)細(xì)胞（如心肌細(xì)胞、心臟成纖維細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等）在各種致病因素（如心臟缺血再灌注損傷、心臟負(fù)荷增加、神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)激活、炎癥系統(tǒng)激活、感染、老齡化等）的作用下均會(huì)產(chǎn)生過量的活性氧或活性氮分子，出現(xiàn)氧化應(yīng)激。這些活性氧/氮分子影響了細(xì)胞內(nèi)正常的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，從而導(dǎo)致一系列基因/蛋白質(zhì)表達(dá)異常。蛋白質(zhì)的異常表達(dá)是心血管疾病發(fā)生發(fā)展及功能損害的基礎(chǔ)，而各種致病因素刺激所導(dǎo)致的細(xì)胞氧化應(yīng)激則是觸發(fā)基因/蛋白質(zhì)異常表達(dá)

2、的“起始信號(hào)”。因此找到能直接被氧化應(yīng)激所激活，并且具有多基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)能力的核蛋白/轉(zhuǎn)錄因子將為心血管疾病的治療探索提供一條新途徑。
　　 I型多聚ADP核糖合成酶（poly(ADP-ribose)polymerase 1，PARP-1，EC 2.4.2.30）是一種存在于除酵母外所有真核細(xì)胞內(nèi)、分子量為113-116KD的核蛋白酶；在細(xì)胞維持其染色體穩(wěn)定、DNA復(fù)制、細(xì)胞凋亡、死亡以及基因轉(zhuǎn)錄等活動(dòng)中均起著重要的作用。作為一種

3、蛋白酶，PARP-1將NAD+中的ADP核糖轉(zhuǎn)移到受體蛋白（包括多種轉(zhuǎn)錄因子以及PARP-1自身等）上形成多聚ADP核糖鏈，從而改變了受體蛋白的生物學(xué)活性，影響其生物學(xué)效應(yīng)的發(fā)揮。新近的研究發(fā)現(xiàn)PARP-1在心肌缺血再灌注損傷、心肌病、心力衰竭、高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化等多種心血管疾病發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要的致病作用。在這些疾病中，PARP-1主要是通過對轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)作用調(diào)控相關(guān)基因/蛋白質(zhì)的表達(dá)。本項(xiàng)研究圍繞PARP-1與不同轉(zhuǎn)錄因子

4、的相互作用機(jī)制深入探討了PARP-1調(diào)控心血管系統(tǒng)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的分子機(jī)制，所得結(jié)果為心血管疾病的發(fā)病機(jī)制研究提供了新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 第一部分：血管緊張素Ⅱ促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞中c-Jun/c-Fos多聚ADP核糖化的機(jī)制研究
　　 目的：c-Jun/c-Fos (活化因子1，AP1)通過調(diào)節(jié)心臟成纖維細(xì)胞中細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的過度表達(dá)在血管緊張素II誘導(dǎo)的心臟纖維化過程中發(fā)揮了重要作用。本部分主要目的是研究在培養(yǎng)的心

5、臟成纖維細(xì)胞中血管緊張素II 促進(jìn)c-Jun/c-Fos轉(zhuǎn)錄激活的機(jī)制。
　　 方法及結(jié)果：通過western blot和免疫共沉淀的方法，我們證實(shí)在培養(yǎng)的心臟成纖維細(xì)胞中c-Jun和c-Fos可以被PARP-1 多聚ADP 核糖化修飾。Southwestern blot和 EMSA研究顯示：將細(xì)胞核抽提物與NAD+和活化的DNA 共孵育能顯著增加c-Jun和AP1的DNA結(jié)合能力；同時(shí)將c-Fos和/或c-Jun 純蛋白與PA

6、RP-1 純蛋白、NAD+和活化的DNA共孵育也能顯著增加c-Jun和AP1的DNA結(jié)合能力。血管緊張素II 處理激活了細(xì)胞內(nèi)的PARP-1，從而增加了c-Fos和c-Jun的多聚ADP 核糖化水平，進(jìn)而促進(jìn)了c-Jun和AP1的DNA結(jié)合。PARP-1 抑制劑PJ34或PARP-1 siRNA 能顯著抑制血管緊張素II誘導(dǎo)的c-Jun和AP1的DNA結(jié)合能力的增加，減少AP1靶基因（包括膠原Iα1和Ⅲα1，基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-9

7、和其組織抑制因子 TIMP-1）的表達(dá)。
　　 結(jié)論：本研究顯示c-Jun和c-Fos可以被PARP-1 多聚ADP 核糖化修飾，而這種修飾能明顯促進(jìn)c-Jun和AP1的DNA結(jié)合。在心臟成纖維細(xì)胞中，血管緊張素II 通過激活PARP-1增加了c-Jun和c-Fos的多聚ADP 核糖化水平，從而增強(qiáng)了AP1 下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。
　　 第二部分：PARP-1 在心臟成纖維細(xì)胞中通過對PPAR-γ的多聚ADP核糖化作用抑制P

8、PAR-轉(zhuǎn)錄激活和脂連素表達(dá)的機(jī)制研究
　　 目的：本部分主要目的是研究大鼠心臟成纖維細(xì)胞中PARP-1與過氧化物酶體增生物激活受體γ（PPAR-γ）相互作用調(diào)控脂連素及其受體轉(zhuǎn)錄的機(jī)制。
　　 方法及結(jié)果：使用western blot和實(shí)時(shí)定量RT-PCR的方法，我們檢測了培養(yǎng)的心臟成纖維細(xì)胞中脂連素及其受體的表達(dá)情況。Southwestern blot和 EMSA 實(shí)驗(yàn)用于研究PPAR γ的DNA結(jié)合能力。結(jié)果顯示，

9、心臟成纖維細(xì)胞中表達(dá)有脂連素和脂連素受體1。PARP 抑制劑3AB 或PJ34，或PARP-1 siRNA不僅能顯著增加心臟成纖維細(xì)胞中脂連素和脂連素受體1的表達(dá)，還能增加其在3T3-L1 脂肪細(xì)胞、心肌組織和白色脂肪組織中的表達(dá)。研究表明，PPAR γ能夠被PARP-1 多聚ADP 核糖化修飾，這種修飾作用顯著抑制了PPAR γ的DNA結(jié)合能力。抑制PARP-1 能夠增強(qiáng)PPAR γ的DNA結(jié)合和轉(zhuǎn)錄激活，從而促進(jìn)脂連素及PPAR γ

10、其他下游基因（如CD36，lipoprotein lipase和 leptin）的轉(zhuǎn)錄水平。
　　 結(jié)論：在心臟成纖維細(xì)胞中，PARP-1 通過對PPAR γ的多聚ADP 核糖化修飾作用抑制了PPAR γ的轉(zhuǎn)錄激活和其下游基因脂連素及其受體的表達(dá)。
　　 第三部分：不穩(wěn)定心絞痛患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中PARP-1的激活和過度表達(dá)促進(jìn)炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-6表達(dá)的機(jī)制研究
　　 目的：炎性細(xì)胞因子的大量表達(dá)在

11、不穩(wěn)定心絞痛的發(fā)病過程中發(fā)揮了重要作用。
　　 研究表明PARP-1 參與了對炎性細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。本部分的主要目的是研究不穩(wěn)定心絞痛患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中PARP-1的激活與患者血漿中炎性細(xì)胞因子腫瘤壞死因子（TNF）-α和白介素（IL）-6 釋放水平的關(guān)系，并闡明PARP-1 通過NF-κ B途徑促進(jìn)炎性細(xì)胞因子表達(dá)的機(jī)制。
　　 方法及結(jié)果：26名Braunwald IIIB 級(jí)不穩(wěn)定心絞痛患者，25名穩(wěn)定型心絞

12、痛患者及25名健康志愿者被納入本研究。使用ELISA 及實(shí)時(shí)定量RT-PCR法檢測血漿及外周血單個(gè)核細(xì)胞中TNF-α和IL-6的表達(dá)水平。使用western blot、EMSA等方法檢測外周血單個(gè)核細(xì)胞中PARP-1的活性和表達(dá)，以及NF-κ B的DNA結(jié)合能力。分離健康志愿者外周血單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng)，研究PARP-1 促進(jìn)NF-κ B轉(zhuǎn)錄激活的機(jī)制。結(jié)果顯示，不穩(wěn)定心絞痛患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中PARP-1的活性和表達(dá)明顯高于穩(wěn)

13、定型心絞痛患者和健康對照組，并且PARP-1的活性和表達(dá)水平與患者TNF-α和IL-6的表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)。同時(shí)不穩(wěn)定心絞痛患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中調(diào)控炎性因子轉(zhuǎn)錄的主要轉(zhuǎn)錄因子NF-κ B的DNA結(jié)合能力也顯著增強(qiáng)。在體外培養(yǎng)的外周血單個(gè)核細(xì)胞中，PARP 抑制劑或PARP-1 siRNA 能夠顯著抑制炎性刺激物脂多糖（LPS）誘導(dǎo)產(chǎn)生的NF-κ B的的激活和炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的表達(dá)。Supershift研究表明PARP