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文檔簡(jiǎn)介
1、花青素是植物界中最大的水溶性色素家族,也是類(lèi)黃酮類(lèi)家族中的一員。在植物體內(nèi),花青素充當(dāng)著響應(yīng)生理和環(huán)境變化的保護(hù)機(jī)制,有利于植物應(yīng)對(duì)各種生物和非生物脅迫?;ㄇ嗨剡€是一種天然的抗氧化劑,能夠保護(hù)人體免受自由基等有害物質(zhì)的傷害,并且在增強(qiáng)血管彈性、預(yù)防心腦血管疾病、保護(hù)肝臟等方面有著重要的作用。此外,花青素作為一種天然無(wú)害色素,在食用色素開(kāi)發(fā)中有著廣泛的應(yīng)用前景。在模式植物、花卉以及果樹(shù)中花青素的合成及轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制已研究得較為清楚,但是關(guān)于
2、茶樹(shù)花青素代謝途徑轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控機(jī)制及轉(zhuǎn)錄因子的作用機(jī)理尚不明確。
本文以高花青素含量茶樹(shù)品種“紫娟”(Camellia sinensisvar.a(chǎn)ssamica,cv.Zijuan)為材料,通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和qRT-PCR找到了四個(gè)與類(lèi)黃酮類(lèi)合成相關(guān)的MYB轉(zhuǎn)錄因子。其中CsAN1的表達(dá)量與“紫娟”中花青素的含量呈極顯著的相關(guān)性,因此我們對(duì)其做了進(jìn)一步的功能驗(yàn)證,結(jié)果如下:
1.以“紫娟”葉片cDNA為模板,克隆了C
3、sAN1、CsGL3、CsEGL3以及CsTTG1的全長(zhǎng),并對(duì)這幾個(gè)基因的氨基酸序列進(jìn)行分析和聚類(lèi)。其中CsAN1具有R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子的典型結(jié)構(gòu)特征,并具有bHLH的結(jié)合位點(diǎn)和調(diào)控花青素合成的KPRPR[S/T]F結(jié)構(gòu)域。聚類(lèi)分析表明CsAN1與中華獼猴桃中調(diào)控花青素合成基因AcMYB110的相似性最高,達(dá)到58%。
2. CsAN1轉(zhuǎn)化本氏煙草促進(jìn)花青素的積累為了檢測(cè)CsAN1在植物體的功能,構(gòu)建了35S::CsAN
4、1超表達(dá)載體轉(zhuǎn)化本氏煙草。CsAN1異位表達(dá)促進(jìn)了煙草葉片花青素的積累,并導(dǎo)致花青素合成結(jié)構(gòu)基因上調(diào)表達(dá),這說(shuō)明CsAN1參與植物花青素的合成。
3. CsAN1具有轉(zhuǎn)錄激活功能并能結(jié)合到CsLDOX1和CsLDOX2的啟動(dòng)子上反式激活和酵母單雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:CsAN1具有自主激活功能,并且能結(jié)合到花青素合成關(guān)鍵基因CsLDOX1和CsLDOX2的啟動(dòng)子上。這說(shuō)明CsAN1能參與調(diào)控茶樹(shù)花青素的合成。
4. CsA
5、N1是MBW復(fù)合物的成員酵母雙雜交與雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:CsAN1與 CsGL3、CsEGL3互作,但不與CsTTG1互作,而CsTTG1也能與CsGL3、CsEGL3互作,這暗示暗示了茶樹(shù)中也 CsAN1、CsGL3、CsEGL3和 CsTTG1可能形成 MBW存在有 MYB、bHLH和WD40重復(fù)蛋白形成的MBW三元復(fù)合物形式轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能。
5. MBW復(fù)合物轉(zhuǎn)錄調(diào)控CsLDOX2啟動(dòng)子的活性雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)
6、結(jié)果顯示:CsAN1能提高CsLDOX2啟動(dòng)子的活性。同時(shí)共轉(zhuǎn)CsAN1、CsTTG1和CsGL3三個(gè)基因,CsLDOX2啟動(dòng)子活性提高更為顯著。這也從側(cè)面輔助證明了CsAN1是通過(guò)形成MBW復(fù)合物調(diào)控花青素合成基因的表達(dá)。
6.“紫娟”CsAN1啟動(dòng)子的低甲基化水平與高花青素含量相關(guān)利用hiTAIL PCR技術(shù)從四個(gè)不同茶樹(shù)品種中克隆出CsAN1的啟動(dòng)子序列,之后用亞硫酸氫鹽測(cè)序分析了“紫娟”和其他綠葉茶樹(shù)品種CsAN1啟動(dòng)
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