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文檔簡介
1、研究背景:
原花青素是目前已知的抗氧化能力最強(qiáng)的天然提取物,遠(yuǎn)高于日常使用的維生素C及維生素E。其具有來源廣泛,提取成本低,毒性低及水溶性好的優(yōu)勢。此外,原花青素的生物體內(nèi)的半數(shù)致死劑量超過5000mg/kg,遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于治療劑量。原花青素對肺組織相關(guān)炎癥及疾病具有較好的治療作用:原花青素可以有效減輕角夾膠誘導(dǎo)的肺組織急性炎癥反應(yīng),減輕小鼠哮喘模型的急性氣道炎癥反應(yīng),抑制肺水腫的形成,且對博來霉素誘導(dǎo)的肺炎具有很好的治療作用。本實(shí)
2、驗室前期研究成果發(fā)現(xiàn),原花青素可以顯著減輕輻照后早期放射性肺炎的炎癥滲出和晚期放射性肺纖維化的發(fā)生,降低輻射所導(dǎo)致的肺組織上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化程度,減輕炎癥因子TGF-β1、ET-1、IFN-γ、IL-4和IL-13的改變程度。另外,與其他抗氧化劑不同的是,原花青素是一種緩釋抗氧化劑,他可以在血液和組織中存留7-10天,發(fā)揮持續(xù)的抗氧化作用,這對于病情進(jìn)行性進(jìn)展的放射性肺損傷的防治具有獨(dú)到的優(yōu)勢。此外,原花青素還具有抗腫瘤作用。過去的十年體外細(xì)
3、胞實(shí)驗和動物實(shí)驗均已經(jīng)證明原花青素對皮膚癌,乳腺癌,前列腺癌,頭頸部腫瘤和肺癌等腫瘤細(xì)胞增殖具有明確抑制作用。研究者還在體外實(shí)驗中證實(shí)原花青素對正常細(xì)胞的生長和活力沒有明顯影響,而只對腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出殺傷作用。綜合以上的特點(diǎn),推測,原花青素有希望在肺癌放療過程中,防護(hù)放射野內(nèi)正常的肺組織的同時,對肺癌細(xì)胞又起到抑制增殖的作用。本課題將重點(diǎn)研究原花青素在肺癌放療中的雙向作用及其分子機(jī)制。
研究目的:
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4、瘤模型的建立。
通過原位肺內(nèi)注射法建立原位肺癌模型。特點(diǎn):以左肺上葉作為肺癌細(xì)胞的生長環(huán)境,通過基質(zhì)膠固定細(xì)胞位置。
?。ǘ┰ㄇ嗨卦诜伟┓暖熤械碾p向作用。
1、原花青素在細(xì)胞作用中的研究。
(1)通過CCK8檢測原花青素在小鼠正常肺上皮細(xì)胞MLE-12及人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B中的毒性;
(2)通過流式檢測及克隆形成率實(shí)驗檢測原花青素對肺正常細(xì)胞的輻射防護(hù)作用及對肺腫瘤細(xì)胞的輻射
5、增敏作用。
2、原花青素在肺癌模型中的作用。
(1)原花青素能夠抑制小鼠腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移
?、僭ㄇ嗨匾种菩∈笃は履[瘤的生長;
?、谠ㄇ嗨匾种菩∈竽[瘤的轉(zhuǎn)移。
(2)原花青素影響荷瘤小鼠局照后的生存狀況;
(3)原花青素對荷瘤小鼠局照后腫瘤大小及肺葉重量的影響;
(4)原花青素減少荷瘤小鼠局照后正常肺組織的炎性滲出;
(5)原花青素能夠減少小鼠肺正常組織照射后
6、的凋亡,而促進(jìn)照射后腫瘤組織的凋亡,同時抑制其增值;
(6)原花青素能夠調(diào)節(jié)Th1/Th2相關(guān)細(xì)胞因子IL-6及IFN-γ的分泌。
?。ㄈ┰ㄇ嗨卦诜伟┓暖熤须p向作用的機(jī)制研究。
1、原花青素可以明顯降低輻照后A549及BEAS-2B細(xì)胞中活性氧的產(chǎn)生;
2、原花青素對肺正常細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞內(nèi)的p-ERK、p-JNK及p-P38表達(dá)情況的影響具有差異;
3、原花青素可以激活肺正常細(xì)胞及腫瘤
7、細(xì)胞Sirt6蛋白的表達(dá);
4、研究肺正常細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞過表達(dá)Sirt6蛋白后p-ERK、p-JNK及p-P38的表達(dá)情況;
5、通過抑制p-ERK、p-JNK及p-P38蛋白的表達(dá),觀察Sirt6的表達(dá)情況,判斷Sirt6蛋白在原花青素中的作用。
研究方法:
?。ㄒ唬┙⑿∈笤环伟┖闪瞿P图胺尾烤植糠派淠P?。
1、用胰島素注射器將腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)膠的混懸液注射入小鼠左上肺葉,建立小鼠肺部
8、原位肺癌荷瘤模型;
2、使用本實(shí)驗室設(shè)計的固定小鼠模具,采取鉛塊遮擋的方式建立肺部局照放射模型;
3、照射方式:采用25Gy60Coγ射線單次照射,劑量率為1Gy/min。
?。ǘ┭芯吭ㄇ嗨卦诜伟┓暖熤械碾p向作用
1、選取小鼠肺上皮細(xì)胞MLE-12、肺癌細(xì)胞LLC及人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B、肺腺癌細(xì)胞A549進(jìn)行試驗;
(1)細(xì)胞分組:對照組、原花青素處理組、照射組、照射組加原花
9、青素處理組,每種細(xì)胞分組相同,照射劑量為8Gy;
(2)細(xì)胞照射及原花青素處理后對正常細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞增殖能力的影響:流式細(xì)胞儀檢測及克隆形成率;
2、在小鼠原位肺癌荷瘤模型的基礎(chǔ)上檢測原花青素的雙向作用
(1)小鼠分為:假手術(shù)對照組、假手術(shù)肺部照射組、肺部荷瘤對照組、肺部荷瘤原花青素處理組、肺部荷瘤照射組及肺部荷瘤原花青素加照射組,共6組,每組選用雄性8周C57BL/6小鼠3只;
(2)原花青素及
10、照射對原位荷瘤小鼠的生存影響:檢測荷瘤小鼠生存期及體重;
(3)原花青素及照射對原位荷瘤小鼠腫瘤的影響:檢測腫瘤大小,H&E染色及小鼠左上肺葉重量;
(4)免疫熒光檢測正常肺組織及腫瘤組織的增殖和凋亡:Ki67和p53染色;
(5)檢測原花青素對小鼠免疫細(xì)胞因子的影響:用ELISA方法檢測小鼠血清細(xì)胞因子IL-6和IFN-γ。
?。ㄈ┰ㄇ嗨卦诜伟┓暖熤须p向作用的分子機(jī)制
1、檢測原花青
11、素對照射后細(xì)胞內(nèi)活性氧的清除:ROS檢測試劑盒;
2、檢測原花青素對照射后細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白變化的影響:Western blot;
3、檢測原花青素對照射后原位荷瘤小鼠正常肺組織及腫瘤組織蛋白的影響:Western blot;
4、通過改變細(xì)胞內(nèi)Sirt6的表達(dá)檢測p-ERK、p-JNK及p-P38蛋白的表達(dá):Sirt6過表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染、Western blot;
5、通過選取抑制劑S1805、SP6
12、00125及SB203580分別抑制p-ERK、p-JNK及p-P38蛋白的表達(dá),觀察Sirt6的表達(dá)情況:Western blot。
研究結(jié)果:
?。ㄒ唬┏晒⑿∈笤环伟┖闪瞿P图胺尾烤植糠派淠P?br> 1、成功建立小鼠左上肺葉原位肺癌荷瘤模型,腫瘤生長符合實(shí)驗要求;
2、成功建立荷瘤小鼠肺部局部照射模型。
?。ǘ┰ㄇ嗨卦诜握<?xì)胞及腫瘤細(xì)胞放療中的雙向作用
1、對小鼠肺正常及
13、腫瘤細(xì)胞的雙向研究:通過流式細(xì)胞儀檢測,發(fā)現(xiàn)原花青素能夠減少小鼠肺上皮細(xì)胞MLE-12照射后的凋亡;通過克隆形成率實(shí)驗,原花青素對小鼠肺上皮細(xì)胞MLE-12具有輻射防護(hù)作用,對小鼠肺癌細(xì)胞LLC具有輻射增敏作用;
2、對人肺正常及腫瘤細(xì)胞的雙向研究:通過流式細(xì)胞儀檢測,發(fā)現(xiàn)原花青素能夠減少人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B凋亡且促進(jìn)人肺腺癌細(xì)胞A549的凋亡;通過克隆形成率實(shí)驗,原花青素對人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B細(xì)胞具有輻射
14、防護(hù)作用,且能夠抑制人肺腺癌細(xì)胞A549的生長,具有輻射增敏作用;
(三)原花青素在原位肺癌荷瘤小鼠放療中的雙向作用研究
1、通過觀察并記錄原位肺癌荷瘤小鼠的生存情況,發(fā)現(xiàn):原花青素處理加照射組相比于照射組,其存活時間更長;
2、通過對小鼠肺內(nèi)腫瘤的測量,發(fā)現(xiàn):原花青素處理加照射抑制小鼠左上肺葉內(nèi)腫瘤的生長,相比較于單純照射組,效果更加明顯;
3、通過熒光免疫分別標(biāo)記增殖相關(guān)蛋白Ki67及凋亡相關(guān)
15、蛋白p53,發(fā)現(xiàn):在小鼠正常肺組織內(nèi),原花青素加照射組與單純照射組相比,p53表達(dá)量明顯降低;在腫瘤組織內(nèi),單純處理組的Ki67的表達(dá)量相比于對照組明顯降低,而原花青素加照射組與單純照射組相比,p53表達(dá)量明顯升高;
4、通過ELISA檢測荷瘤小鼠血清細(xì)胞因子的表達(dá)量,發(fā)現(xiàn):原花青素加照射組相比于單純照射組,能夠明顯抑制IL-6、提高IFN-γ的表達(dá),促進(jìn)對腫瘤的抑制,降低炎性損傷。
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16、作用機(jī)制
1、原花青素能夠顯著清除人肺癌細(xì)胞A549及正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B照射后所產(chǎn)生的自由基;
2、在人肺癌細(xì)胞A549中,原花青素明顯提高照射后p-JNK蛋白的表達(dá);在人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B中,原花青素可以明顯抑制p-JNK、p-ERK及p-P38的增高,而這與其能夠清除活性氧自由基有關(guān)。
3、在人肺癌細(xì)胞A549中,原花青素通過增加Sirt6蛋白的表達(dá)進(jìn)而改變p-JNK、p-P38蛋白
17、的變化,促進(jìn)輻射增敏作用
研究結(jié)論:
在細(xì)胞層面上發(fā)現(xiàn),原花青素對小鼠肺癌細(xì)胞LLC及人肺癌細(xì)胞A549具有輻射增敏作用,對小鼠肺正常細(xì)胞MLE-12及人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B具有輻射防護(hù)作用。在人肺癌細(xì)胞A549中,原花青素可以通過提高Sirt6蛋白的表達(dá)進(jìn)而改變p-JNK、p-P38蛋白的變化,促進(jìn)輻射增敏作用。在人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B中,原花青素可能通過清除活性氧自由基,抑制p-JNK、p-ERK
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