鎘致糖尿病腎病小鼠發(fā)病機(jī)制及原花青素保護(hù)作用研究.pdf

1、目前全球糖尿病患者達(dá)4億余人，且增長(zhǎng)率居高不下，其中約20％患者最終將發(fā)展為糖尿病腎病。糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，在不斷加深的器質(zhì)損傷病程中，系膜細(xì)胞和其外基質(zhì)不斷增加且基底膜不斷增厚，最終導(dǎo)致腎小球硬化。環(huán)境污染物重金屬鎘對(duì)機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激，損傷腎臟功能，可能紊亂糖脂平衡，加劇糖尿病腎病發(fā)生，但發(fā)病機(jī)制不明。代謝組學(xué)可對(duì)體內(nèi)代謝物的變化進(jìn)行定性或定量分析，檢測(cè)方法簡(jiǎn)單穩(wěn)定，有利于尋找潛在生物標(biāo)記物，探尋誘發(fā)生理病理變化的相關(guān)通路，對(duì)藥物

2、篩選提供依據(jù)。
　　本研究擬采用高脂高糖喂養(yǎng)聯(lián)合腹腔注射氯化鎘誘導(dǎo)，構(gòu)建糖尿病腎病小鼠模型。通過生理生化指標(biāo)及組織形態(tài)學(xué)觀察驗(yàn)證模型，利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）檢測(cè)血清代謝輪廓譜，結(jié)合主成分分析等統(tǒng)計(jì)方法分析對(duì)照組、糖尿病腎病模型組及原花青素保護(hù)組代謝物，尋找與糖尿病腎病發(fā)生相關(guān)的生物標(biāo)記物。從氧化應(yīng)激水平、金屬元素水平以及相關(guān)蛋白表達(dá)水平多方面對(duì)鎘誘導(dǎo)糖尿病腎病小鼠發(fā)生機(jī)制及原花青素的保護(hù)作用進(jìn)行初步的探討，旨在為

3、糖尿病腎病的臨床診斷及藥物開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　?。?）糖尿病腎病小鼠模型的構(gòu)建及生理生化指標(biāo)檢測(cè)
　　采用高脂高糖喂養(yǎng)聯(lián)合腹腔注射氯化鎘誘導(dǎo)的方法構(gòu)建糖尿病腎病小鼠模型，對(duì)不同實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行生理生化指標(biāo)檢測(cè)和組織形態(tài)學(xué)觀察以確定模型構(gòu)建成功。結(jié)果表明，糖尿病腎病模型組中小鼠空腹血糖、腎臟臟器系數(shù)顯著高于對(duì)照組（*P<0.05、*P<0.05），小鼠體重均值極顯著低于對(duì)照組（***P<0.001），甘油三酯、總膽固醇含量較對(duì)照組

4、顯著變化（*P<0.05、*P<0.05），高密度脂蛋白含量顯著低于對(duì)照組（*P<0.05），低密度脂蛋白含量極顯著高于對(duì)照組（**P<0.01），血清中肌酐含量極顯著高于對(duì)照組（***P<0.001），尿液中肌酐含量極顯著低于對(duì)照組（**P<0.01），尿液微量白蛋白極顯著高于對(duì)照組（**P<0.01），說明高脂高糖喂養(yǎng)聯(lián)合腹腔注射氯化鎘誘導(dǎo)的方法對(duì)小鼠造成損傷。給予原花青素治療后，體重、臟器系數(shù)、甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白、血

5、清肌酐、尿液肌酐及微量白蛋白都有顯著改善，說明鎘能誘發(fā)糖尿病腎病，原花青素能對(duì)鎘誘發(fā)的糖尿病腎病具有一定保護(hù)作用。
　?。?）糖尿病腎病小鼠原花青素給藥前后血清代謝物譜分析
　　采用GC-MS檢測(cè)不同組別的血清，利用代謝組學(xué)的研究思路，對(duì)對(duì)照組、糖尿病腎病模型組、原花青素保護(hù)組的小鼠血清代謝譜進(jìn)行分析，尋找潛在的生物標(biāo)志物。結(jié)果表明，糖尿病腎病模型組血清中半乳糖、單酰甘油、α-亞麻酸含量顯著低于對(duì)照組（*P<0.05、**P

6、<0.01、**P<0.01），膽固醇含量顯著高于對(duì)照組（*P<0.05）。經(jīng)過OPC治療四周后，半乳糖含量顯著高于模型組（＃P<0.05），膽固醇含量顯著低于模型組（＃P<0.05），單酰甘油和α-亞麻酸含量變化沒有顯著性。半乳糖和膽固醇可能與鎘誘導(dǎo)糖尿病腎病的氧化應(yīng)激有關(guān)。
　　（3）糖尿病腎病小鼠發(fā)病機(jī)制研究
　　對(duì)不同實(shí)驗(yàn)組小鼠腎臟的抗氧化指標(biāo)谷胱甘肽、超氧化物歧化酶（GSH、SOD）、氧化指標(biāo)蛋白羰基化、脂質(zhì)過氧化

7、（PCO、MDA）及炎癥因子一氧化氮（NO）進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表示模型組腎臟抗氧化酶GSH、SOD顯著低于對(duì)照組（*P<0.05、**P<0.01），氧化指標(biāo) PCO、MDA含量顯著高于對(duì)照組（**P<0.01、**P<0.01），炎癥因子 NO含量顯著高于對(duì)照組（*P<0.05）；給予 OPC治療后，與模型組比較抗氧化指標(biāo)活性上升（＃P<0.05），氧化指標(biāo)的上升被有效抑制（＃＃P<0.01）。
　　對(duì)不同實(shí)驗(yàn)組小鼠腎臟的元素鎘、銅

8、、鋅、鐵、鈣（Cd2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+、Ca2+）進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表示模型組腎臟Cd2+、Fe2+、Ca2+含量顯著高于對(duì)照組（**P<0.01、*P<0.05、**P<0.01）， Cu2+、Zn2+含量顯著低于對(duì)照組（*P<0.05、*P<0.05）；給予OPC治療后，與模型組比較Fe2+、Ca2+含量顯著減少（＃P<0.05、＃P<0.05），Cu2+、Zn2+含量顯著增加（＃P<0.05、＃P<0.05）。
　

9、　對(duì)不同實(shí)驗(yàn)組小鼠腎臟的MAPK信號(hào)通路（MAPK蛋白、ERK蛋白、p38蛋白）、Nrf2信號(hào)通路（Nrf2蛋白、Keap1蛋白）、Ⅱ相解毒酶（NQO1蛋白）進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表示模型組腎臟MAPK信號(hào)通路中MAPK蛋白和p38蛋白表達(dá)上調(diào)（*P<0.05、**P<0.01），ERK蛋白表達(dá)變化不大；Nrf2信號(hào)通路中Nrf2蛋白表達(dá)下調(diào)（*P<0.05），Keap1蛋白表達(dá)上調(diào)（*P<0.05）；Nrf2信號(hào)通路的下游蛋白NQO1表達(dá)上調(diào)