高粱原花青素干預(yù)齲齒的作用機(jī)制.pdf

1、齲齒是一種人類廣泛流行的慢性疾病，在青少年和兒童中的發(fā)生率很高。但是現(xiàn)有的治療藥物和治療方法均存在一定局限，因此尋找一種使用安全、高效的防齲藥物成為預(yù)防齲齒研究的重點(diǎn)。近些年天然植物多酚預(yù)防齲齒的相關(guān)研究引起諸多學(xué)者的廣泛關(guān)注，原花青素是植物中存在的一類天然多酚化合物，其分子結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)活性酚羥基，因而具有廣泛的抑菌譜、抑制酶活性和結(jié)合蛋白質(zhì)的能力，研究證實(shí)原花青素可能是一種值得高度關(guān)注的預(yù)防齲齒的藥物。本論文選取高粱外種皮為原料，在

2、對(duì)其中的原花青素進(jìn)行提取、分離和鑒定的基礎(chǔ)上，重點(diǎn)研究高粱原花青素SPC-5（主要為三聚體）分別與唾液和獲得性膜作用后對(duì)致齲齒菌粘附的影響，表征了SPC-5與唾液蛋白以及獲得性膜蛋白的相互作用，并以豬胰腺Ⅱ-淀粉酶作為人唾液α-淀粉酶的蛋白質(zhì)模型，探究了SPC-5與其作用機(jī)理。主要研究?jī)?nèi)容和實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1.采用乙醇/水溶液對(duì)高粱外種皮中原花青素進(jìn)行提取，通過ADS-17大孔樹脂進(jìn)行純化獲得目標(biāo)產(chǎn)物高粱原花青素（Sorghu

3、mprocyanidins，SPC），經(jīng)ToyopearlHW-40凝膠色譜分離后結(jié)合Ultra-violetspectroscopy(UV)、花青素反應(yīng)、ElectrosprayIonization-MassSpectroscopy(ESI-MS)和Reversephasehigh-performanceliquidchromatography-MassSpectroscopy/MassSpectroscopy(RP-HPLC-ESI

4、-MS)對(duì)SPC和凝膠色譜分離的級(jí)分進(jìn)行分離鑒定。純化后產(chǎn)物得率為2.2％，原花青素純度為97.4％。通過ESI-MS和RP-HPLC-ESI-MS/MS分析發(fā)現(xiàn):SPC含有兒茶素/表兒茶素單體、原花青素二聚體、三聚體、四聚體、五聚體和六聚體。SPC經(jīng)凝膠色譜分離的一個(gè)積分SPC-5主要由8種原花青素三聚體和1種二聚體組成，且不同異構(gòu)體得到分離。
　　2.采用熒光標(biāo)記法和熒光顯微鏡法研究SPC-5與唾液和獲得性膜作用后對(duì)致齲齒菌粘

5、附的影響，SPC-5在0-1mg/mL低濃度范圍內(nèi)，作用于唾液后對(duì)StreptococcusmutansIngbritt(C)粘附的抑制具有濃度效應(yīng)關(guān)系，隨著SPC-5濃度的升高，StreptococcusmutansIngbritt(C)的粘附率依次減少;當(dāng)SPC-5濃度大于2mg/mL，作用于唾液后對(duì)StreptococcusmutansIngbritt(C)粘附的抑制作用有所降低，且高濃度的SPC-5抑制作用趨于穩(wěn)定。SPC-5在

6、0.5-4mg/mL的范圍內(nèi)作用于唾液獲得性膜后，StreptococcusmutansIngbritt(C)對(duì)獲得性膜的粘附均減少，粘附率均降低，且隨著SPC-5濃度的升高，StreptococcusmutansIngbritt(C)對(duì)獲得性膜的粘附率逐漸減少，具有一定的濃度效應(yīng)關(guān)系。SPC-5濃度在4、2、1及0.5mg/mL作用于唾液和獲得性膜時(shí)，菌粘附的熒光強(qiáng)度均減小，與SPC-5濃度為0mg/mL的對(duì)照組比較都具有顯著性差異(

7、P＜0.05)。SPC-5與獲得性膜相互作用是其干預(yù)致齲齒菌的粘附主要途徑。
　　3.采用Sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis(SDS-PAGE)及Matrix-AssistedLaserDesorption/IonizationTimeofFlightMassSpectrometry(MALDI-TOF-MS)相結(jié)合的方法研究了SPC-5與唾液蛋白和唾液獲得性膜

8、蛋白的相互作用;并通過雙向電泳對(duì)SPC-5與唾液獲得性膜作用前后的蛋白進(jìn)行分離，對(duì)于作用前后的差異蛋白點(diǎn)采用MALDI-TOF-MS進(jìn)行鑒定，從而判斷與SPC-5發(fā)生作用的蛋白。唾液蛋白和唾液獲得性膜蛋白與SPC-5作用后SDS-PAGE電泳色帶均變淡變窄，說明了它們之間發(fā)生了相互作用。經(jīng)MALDI-TOF-MS分析后得出，唾液蛋白與經(jīng)2.0mg/mLSPC-5處理的唾液蛋白的電泳色帶的蛋白成分只有兩種相同蛋白，其他8種均發(fā)生變化;獲得

9、性膜蛋白和經(jīng)2.0mg/mLSPC-5作用的唾液獲得性膜蛋白電泳色帶的蛋白成分中含有7種相同的蛋白，3種不同的蛋白，均為唾液淀粉酶類。進(jìn)一步說明SPC-5與唾液蛋白和獲得性膜蛋白相互作用改變了蛋白成分。獲得性膜蛋白與SPC-5作用后，雙向電泳凝膠上的蛋白點(diǎn)明顯變少，顏色也變淡，且灰度值變化較大的點(diǎn)經(jīng)MALDI-TOF-MS分析后，A10為核苷酸類，A23為人體蛋白類。
　　4.以豬胰腺α-淀粉酶(Porcinepancreatic

10、alpha-amylase(PPA)，與唾液α-淀粉酶具有相同的一、二、三級(jí)結(jié)構(gòu)）作為人唾液α-淀粉酶蛋白質(zhì)模型，通過熒光猝滅法、圓二色譜法及紫外光譜法研究SPC-5與之作用機(jī)理。熒光光譜分析結(jié)果表明SPC-5對(duì)PPA的Stem-Volmer猝滅常數(shù)Ksv為2639.5M-1，雙分子猝滅常數(shù)Kq為2.6395×1011M-1.s-1，SPC-5與PPA結(jié)合常數(shù)K為872.971M-1，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n為1，SPC-5猝滅劑對(duì)PPA的表觀靜態(tài)

11、猝滅常數(shù)K為495.19M-1，證實(shí)原花青素對(duì)PPA的猝滅為動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅的過程。圓二色譜的結(jié)果分析證實(shí)SPC-5對(duì)PPA的二級(jí)結(jié)構(gòu)影響很大，主要作用于β-折疊結(jié)構(gòu)和β-轉(zhuǎn)角，SPC-5的濃度在0-1mg/mL的范圍內(nèi)時(shí)PPA的β-折疊結(jié)構(gòu)的百分比逐漸降低，β-轉(zhuǎn)角的百分比逐漸升高，無規(guī)則卷曲的百分比變化不明顯。不同濃度SPC-5對(duì)PPA的紫外光譜影響是:隨著SPC-5溶液濃度的升高，PPA的紫外吸收光譜峰值依次升高，并且產(chǎn)生了紅移