法尼基焦磷酸合成酶在心血管重塑中的作用研究.pdf

1、第一部分法尼基焦磷酸合成酶過表達導致心肌肥厚和心力衰竭
　　 研究背景:
　　 心肌肥厚和充血性心力衰竭是全世界人類死亡的主要原因之一。心肌肥厚是心力衰竭早期心肌細胞對室壁應力增加的一種重要的適應性、代償性反應，最終會導致充血性心力衰竭。
　　 法尼基焦磷酸合成酶(famesyl pyrophosphate synthase，F(xiàn)PPS)是甲羥戊酸途徑中的一種關鍵酶，它催化合成異戊二烯化產物，包括法尼基焦磷酸(FP

2、P)和牻牛兒牻牛兒焦磷酸(GGPP)。最新的研究表明FPPS在血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導的心肌肥厚細胞中以及自發(fā)性高血壓大鼠中表達明顯增高，同時在自發(fā)性高血壓大鼠中抑制FPPS可以減輕心肌肥厚和改善血管重塑。這些結果都與RhoA相關，而GGPP對RhoA的牻牛兒牻牛兒焦磷酸化和活化非常重要。
　　 目的:
　　 本研究利用轉基因動物模型來進一步探討FPPS與心肌肥厚和心力衰竭的關系，并研究其機制。
　　 方法:

3、
　　 (1)構建心臟特異性過表達FPPS轉基因模型。
　　 (2)使用real-time PCR、western-blot、免疫組化等技術檢測轉基因小鼠心臟組織中FPPS表達水平。
　　 (3)使用高效液相色譜法(HPLC)技術檢測轉基因小鼠心臟組織中FPP和GGPP水平，酶法測定組織膽固醇濃度。
　　 (4)使用超聲心動圖、病理染色、心導管等方法檢測轉基因小鼠心臟功能及形態(tài)學變化。
　　 (5

4、)使用real-time PCR技術檢測小鼠心臟心肌肥厚基因(ANP、BNP、β-MHC)以及心肌纖維化基因(TGF-β、CTGF)表達。
　　 (6)使用G-Lisa方法檢測小鼠心臟RhoA、Rac1、Cdc42、Ras等小G蛋白表達水平，使用western-blot方法檢測小鼠心臟Erkl/2、P38 MAPK、Akt/GSK3β等的活性。
　　 (7)表達FPPS的腺病毒感染心肌細胞，免疫熒光鑒定心肌細胞表面積。F

5、PPS抑制劑阿倫磷酸鈉或者Rho的抑制劑C3 exoenzyme、Ras抑制劑farnesylthiosalicylic acid(FTS)在感染后加入心肌細胞。
　　 (8)在腺病毒感染的心肌細胞中檢測RhoA、Ras、Erkl/2、P38 MAPK、Ak/GSK3β等活性。
　　 (9)使用HPLC技術檢測心肌細胞中FPP和GGPP水平，酶法測定細胞膽固醇濃度。
　　 結果:
　　 (1)轉基因小鼠心

6、臟組織中FPPS表達明顯增加。
　　 (2)心臟特異性表達FPPS增加了FPP和GGPP、膽固醇合成。
　　 (3)心臟特異性表達FPPS誘導心肌肥厚基因(ANP、BNP、β-MHC)、心肌纖維化基因(TGF-β、CTGF)表達增高，最終導致心肌肥厚、纖維化、心力衰竭。
　　 (4)心肌細胞腺病毒過表達FPPS誘導心肌細胞肥厚基因表達、細胞體積增大。心肌細胞中加入阿倫磷酸鈉或者C3 exoenzyme可抑制FPP

7、S過表達導致的心肌細胞肥大。
　　 (5)心臟特異性表達FPPS誘導RhoA活性增高，磷酸化的ERK和p38表達上調，與體內結果一致，心肌細胞腺病毒過表達FPPS導致RhoA活性增高，磷酸化的ERK和p38表達上調。
　　 結論:
　　 FPPS及FPPS調控的信號轉導通路在心肌重塑過程中具有重要的作用。
　　 第二部分體內抑制法尼基焦磷酸合成酶改善血管緊張素Ⅱ誘導的心肌肥厚和纖維化
　　 研究背

8、景:
　　 血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)是一種血管加壓素，腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)的八肽激素中間體。相當多的證據表明，AngⅡ在心肌肥厚和纖維化起著重要的作用。在以往的研究中，我們發(fā)現(xiàn)FPPS的表達水平在AngⅡ刺激的肥厚心肌細胞中顯著增加，這表明FPPS在AngⅡ引起的心肌肥厚中發(fā)揮著重要的作用。另外也研究發(fā)現(xiàn)在心肌細胞中通過小分子RNA干擾抑制FPPS基因表達或者藥物阿倫磷酸鈉抑制FPPS可以阻止AngⅡ誘導的心肌細胞肥大

9、。
　　 目的:
　　 本研究觀察抑制FPPS對體內AngⅡ介導的心肌肥厚和纖維化的影響，并探討其機制。
　　 方法:
　　 (1)野生型小鼠分為四組:生理鹽水，血管緊張素Ⅱ（2.88毫克/公斤/天），阿倫磷酸鈉（0.1毫克/公斤/天），或血管緊張素Ⅱ（2.88毫克/公斤/天）和阿倫磷酸鈉（0.1毫克/公斤/天）持續(xù)微泵注射4周。
　　 (2)使用real-time PCR、western-blo

10、t等技術檢測各組小鼠心臟組織中FPPS表達水平。
　　 (3)使用HPLC技術檢測各組小鼠心臟組織中FPP和GGPP水平。
　　 (4)使用超聲心動圖、病理染色等方法檢測各組小鼠心臟功能及形態(tài)學變化。
　　 (5)使用real-time PCR技術檢測各組小鼠心肌肥厚基因（ANP、BNP）以及心肌纖維化基因(TGF-β1、ProcollagenⅠ、ProeollagenⅢ)表達。
　　 (6)使用G-Li

11、sa方法檢測RhoA蛋白表達水平，western-blot方法檢測P38 MAPK的活性。
　　 結果:
　　 (1) AngⅡ誘導小鼠心肌肥厚和纖維化。
　　 (2)抑制FPPS改善AngⅡ誘導的小鼠心肌肥厚和纖維化。
　　 (3)AngⅡ增加FPPS的表達，抑制FPPS減少AngⅡ小鼠中磷酸化P-38的表達。
　　 (4)抑制FPPS降低AngⅡ誘導的ANP, BNP, TGF-β1，Proc

12、ollagenⅠ，ProcollagenⅢ mRNA及ANP, TGF-β1，collagenⅠ，collagenⅢ蛋白表達增加。
　　 (5)抑制FPPS降低AngⅡ誘導的FPP和GGPP水平增加。
　　 (6)抑制FPPS減少AngⅡ誘導的RhoA活性增加。
　　 結論:
　　 FPPS在AngⅡ誘導的心肌肥厚和纖維化過程中具有重要的作用，至少部分是通過抑制RhoA的活化，減少p38的磷酸化和下調TG