法尼基焦磷酸合成酶在血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)心肌纖維化中的研究.pdf

1、第一部分抑制法尼基焦磷酸合成酶改善血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌纖維化
　　研究背景:
　　心肌成纖維細胞是心臟中的主要細胞，在心肌纖維化的過程中發(fā)揮重要作用。許多體液刺激因子可誘導(dǎo)心肌纖維化，例如血管緊張素Ⅱ、內(nèi)皮素1等。多種細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌纖維化，如RhoA通路。
　　以往的研究表明雙膦酸鹽，如阿倫磷酸鈉、唑來磷酸鈉等，可抑制甲羥戊酸途徑中的一種關(guān)鍵酶—法尼基焦磷酸合成酶，從而抑制法尼基化和牻牛

2、兒基牻牛兒基化，進而減少異戊二烯的合成，而牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸對于RhoA的牛兒基牻牛兒基化和活化非常重要。
　　目的:
　　本實驗主要研究唑來磷酸鈉是否可通過抑制法尼基焦磷酸合成酶進而抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌纖維化，同時研究該作用是否與RhoA通路相關(guān)。
　　方法:
　　(1)、在心肌成纖維細胞中加入10-30μM唑來磷酸鈉作用30分鐘，然后加入0.1μM血管緊張素Ⅱ作用48小時，加藥前細胞在無血清培養(yǎng)基中

3、孵育24小時，檢測心肌纖維化指標如Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、轉(zhuǎn)化生長因子β1以及法尼基焦磷酸合成酶蛋白水平的改變。
　　(2)、在心肌成纖維細胞中加入10μM唑來磷酸鈉以及相同濃度的FOH或者GGOH作用30分鐘，然后加入0.1μM血管緊張素Ⅱ作用48小時，加藥前細胞在無血清培養(yǎng)基中孵育24小時，檢測心肌纖維化指標如Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、轉(zhuǎn)化生長因子β1以及法尼基焦磷酸合成酶蛋白和RNA水平的改變。
　　(3)、在心肌成纖維細胞中加

4、入10μM唑來磷酸鈉以及相同濃度的GGOH作用48小時，然后加入1μM血管緊張素Ⅱ作用15分鐘，加藥前細胞在無血清培養(yǎng)基中孵育24小時，使用pull-down試劑盒和western blot技術(shù)檢測活性和總RhoA的改變。
　　(4)、在心肌成纖維細胞中加入50μM siRhoA或control siRNA作用24小時，然后在無血清培養(yǎng)基中孵育24小時后加入0.1μM血管緊張素Ⅱ作用48小時，檢測心肌纖維化指標如Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原

5、、轉(zhuǎn)化生長因子β1以及法尼基焦磷酸合成酶蛋白和RNA水平的改變。
　　結(jié)果:
　　(1)、唑來磷酸鈉作為法尼基焦磷酸合成酶抑制劑可劑量依賴性抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌纖維化指標如Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、轉(zhuǎn)化生長因子β1以及法尼基焦磷酸合成酶蛋白水平的表達。
　　(2)、GGOH部分逆轉(zhuǎn)了唑來磷酸鈉的抗心肌纖維化反應(yīng)。
　　(3)、血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌纖維化反應(yīng)與RhoA活化相關(guān)。
　　(4)、siRhoA抑制

6、了血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌纖維化指標如Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、轉(zhuǎn)化生長因子β1以及法尼基焦磷酸合成酶蛋白和RNA水平的表達。
　　結(jié)論:
　　本研究實驗結(jié)果表明唑來磷酸鈉通過抑制法尼基焦磷酸合成酶可有效逆轉(zhuǎn)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌纖維化，這種結(jié)果與抑制RhoA的活化和牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸化相關(guān)。同時，抑制RhoA的活性可抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌纖維化和法尼基焦磷酸合成酶的表達。
　　第二部分 RNA干擾技術(shù)沉默法尼基焦磷酸

7、合成酶改善血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌纖維化
　　研究背景:
　　第一部分實驗結(jié)果表明抑制法尼基焦磷酸合成酶可以逆轉(zhuǎn)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌纖維化，提示法尼基焦磷酸合成酶可能是血管緊張素Ⅱ介導(dǎo)心肌纖維化的重要靶點。以往的實驗證明，在體內(nèi)和體外水平的心肌肥厚模型中，法尼基焦磷酸合成酶的表達明顯升高，同時，在血管緊張素Ⅱ介導(dǎo)的心肌纖維化模型中，RhoA活性表達明顯上升。上述證據(jù)表明法尼基焦磷酸合成酶可能在血管緊張素Ⅱ介導(dǎo)的心肌纖維化模型

8、中的重要性，以及可能與RhoA激活相關(guān)。本實驗探索法尼基焦磷酸合成酶是否在血管緊張素Ⅱ介導(dǎo)的心肌纖維化反應(yīng)中上調(diào)，同時在此基礎(chǔ)上通過RNA干擾技術(shù)沉默法尼基焦磷酸合成酶，觀察是否影響心肌纖維化的形成，探索法尼基焦磷酸合成酶下游RhoA活性的變化。
　　目的:
　　本實驗探索法尼基焦磷酸合成酶是否在血管緊張素Ⅱ介導(dǎo)的心肌纖維化反應(yīng)中上調(diào)，同時在此基礎(chǔ)上通過RNA干擾技術(shù)沉默法尼基焦磷酸合成酶，觀察是否影響心肌纖維化的形成，探索

9、法尼基焦磷酸合成酶下游RhoA活性的變化。
　　方法:
　　(1)、使用western blot和real-time PCR技術(shù)檢測血管緊張素Ⅱ介導(dǎo)的體內(nèi)和心肌纖維化模型中法尼基焦磷酸合成酶轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的改變。
　　(2)、選擇法尼基焦磷酸合成酶重組慢病毒轉(zhuǎn)染乳鼠心肌成纖維細胞，觀察法尼基焦磷酸合成酶下調(diào)是否影響心肌纖維化指標如Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、轉(zhuǎn)化生長因子β1的改變。
　　(3)、進一步在細胞水平研究法尼基

10、焦磷酸合成酶沉默后下游RhoA的改變，使用pull-down試劑盒和western blot技術(shù)檢測活性RhoA和總RhoA的改變。
　　結(jié)果:
　　(1)、血管緊張素Ⅱ在誘導(dǎo)心肌纖維化形成的同時也引起法尼基焦磷酸合成酶的上調(diào)，同時在8周齡大鼠血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的纖維化心臟中法尼基焦磷酸合成酶的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平也上調(diào)。
　　(2)、法尼基焦磷酸合成酶重組慢病毒轉(zhuǎn)染乳鼠心肌成纖維細胞可明顯抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌纖維化指標