經(jīng)典的瞬時受體電位通道蛋白-1在血管緊張素Ⅱ促心肌纖維化中的作用及纈沙坦干預研究.pdf

1、本研究分為三部分：
　　 第一部分：經(jīng)典的瞬時受體電位通道蛋白在大鼠纖維化心肌中的表達
　　 目的：研究經(jīng)典的瞬時受體電位通道（TRPC）在纖維化心肌中的表達，為探討TRPC 通道蛋白在心肌纖維化中的作用奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：雄性SD大鼠20只，體重180～220g，隨機分為兩組,每組10只：假手術(shù)組 (sham-operated group，Sham)，分離腹主動脈但不結(jié)扎；腹主動脈縮窄組（coarctati

2、onof abdominal aorta group，CAA），行腹主動脈縮窄術(shù)。術(shù)后4 周采用頸動脈測壓法記錄大鼠血壓后，處死大鼠切取心臟，HE 染色觀察心臟結(jié)構(gòu)，并計算心臟與體重比值（心室容積分數(shù)）。苦味酸酸性復紅法膠原纖維染色（Van-Gieson，VG）測定Ⅰ、Ⅲ型膠原，RT-PCR 及Western blot 測定心臟組織中TRPC基因及蛋白表達，免疫組織化學方法進一步檢測TRPC 在心臟組織中的分布與表達。
　　 結(jié)

3、果：CAA組術(shù)后4 周大鼠血壓、左室容積分數(shù)及Ⅰ、Ⅲ型膠原容積分數(shù)顯著高于Sham組（P<0.01）。CAA組與Sham組比較：TRPC1基因與蛋白表達明顯增加，有顯著統(tǒng)計學差異（P<0.01）；TRPC3基因與蛋白表達無明顯變化，無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）；TRPC6基因與蛋白表達均明顯較少，2組無明顯差異。TRPC1與心?、瘛ⅱ笮湍z原容積分數(shù)呈明顯正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)r1=0.961，P<0.01；r2=0.986 P<0.01）。免

4、疫組織化學染色進一步證實TRPC1 蛋白沿細胞膜分布并在纖維化心肌中表達增多。
　　 結(jié)論：纖維化心肌中TRPC1 蛋白表達明顯增加，可能在腹主動脈縮窄引起的心肌纖維化中發(fā)揮重要作用。
　　 第二部分：經(jīng)典的瞬時受體電位通道蛋白-1在血管緊張素Ⅱ促心肌成纖維細胞增殖及TGF-β1表達中的作用
　　 目的：研究血管緊張素Ⅱ（angiotensin，Ⅱ Ang Ⅱ）對心肌成纖維細胞中TRPC1通道表達及功能的影響，并

5、采用阻斷TRPC1 通道等藥物干預，探討Ang Ⅱ?qū)π募〕衫w維細胞增殖及轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor beta,TGF-β1）表達的影響，旨在闡明TRPC1 通道蛋白在Ang Ⅱ促心肌纖維化中的作用。
　　 方法：分離乳鼠心肌成纖維細胞，運用實時定量PCR 及Western blot檢測不同濃度的Ang Ⅱ(10-7 ﹑10-6 ﹑10-5 mol·L-1）或高濃度(10-5 mol·

6、L-1）的Ang Ⅱ在不同時間(0 ﹑12和24h)對心肌成纖維細胞TRPC1 及TGF-β1基因與蛋白表達的影響；繼而，在高Ang Ⅱ狀態(tài)下(10-5 mol·L-1），分別加入以下藥物：TRPC1的阻斷劑SKF96365 ﹑內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP 抑制劑毒胡蘿卜素或L型Ca2+通道阻斷劑維拉帕米培養(yǎng)心肌成纖維細胞24h，采用MT T、實時定量PCR和Western blot 觀察心肌成纖維細胞增殖及TGF-β1表達變化；此外，采用激

7、光掃描共聚焦顯微鏡觀察毒胡羅卜素或SKF96365 預處理心肌成纖維細胞30min，高濃度Ang Ⅱ（10-5 mol·L-1）對心肌成纖維細胞胞漿中Ca2+的影響。
　　 結(jié)果：Ang Ⅱ呈濃度與時間依賴性升高心肌成纖維細胞中TRPC1基因與蛋白表達。SKF96365 及毒胡蘿卜素均可明顯抑制Ang Ⅱ（10-5 mol·L-1）刺激24h后誘導的心肌成纖維細胞增殖及TGF-β1表達（P<0.01）；維拉帕米抑制心肌成纖維細胞

8、增殖（P<0.01），但TGF-β1表達無明顯減少（P＞0.05）。高濃度Ang Ⅱ（10-5 mol·L-1）顯著升高細胞內(nèi)游離Ca2+濃度（P<0.01）；毒胡蘿卜素預處理30min，當胞外液無Ca2+時，Ang Ⅱ引起胞內(nèi)Ca2+一過性升高；當胞外存在Ca2+時，Ang Ⅱ引起的胞內(nèi)Ca2+持續(xù)增加；SKF96365 明顯抑制Ang Ⅱ升高胞漿Ca2+濃度效應。
　　 結(jié)論：心肌成纖維細胞中，TRPC1表達可隨Ang Ⅱ濃

9、度或刺激時間增加而增加；Ang Ⅱ通過促進鈣庫內(nèi)Ca2+釋放，繼而激活鈣庫操縱的鈣通道（SOC），致胞外Ca2+內(nèi)流，胞漿內(nèi)Ca2+濃度升高；TRPC1 蛋白可能為SOC的分子實體，通過介導胞外Ca2+內(nèi)流，促進 Ang Ⅱ刺激的心肌成纖維細胞增殖及TGF-β1表達；SKF96365可阻斷TRPC1表達及功能發(fā)揮抗纖維化作用。
　　 第三部分：纈沙坦對心肌成纖維細胞中經(jīng)典的瞬時受體電位通道蛋白-1表達的影響
　　 目的：

10、研究不同濃度的纈沙坦在高Ang Ⅱ狀態(tài)下對心肌成纖維細胞TRPC1 通道表達的影響。
　　 方法：分離乳鼠心肌成纖維細胞，分別給予不同濃度的纈沙坦（5umol·L-1，10umol·L-1和100umol·L-1）與Ang Ⅱ（10-5 mol·L-1）共同作用心肌成纖維細胞24h，采用MTT檢測心肌成纖維細胞的增殖；實時定量PCR和Western blot檢測TRPC1和TGF-β1基因及蛋白表達變化。
　　 結(jié)果：A