構(gòu)巢曲霉磷酸核糖焦磷酸合成酶(PRS)家族的生物學(xué)功能研究及其對(duì)酶活力的協(xié)同調(diào)控作用.pdf

1、磷酸核糖焦磷酸合成酶(PRS)在體內(nèi)催化五磷酸核酮糖(R-5-P)和三磷酸腺苷(ATP)合成磷酸核糖焦磷酸（PRPP）。其產(chǎn)物PRPP參與體內(nèi)的多種代謝途徑，例如磷酸戊糖途徑，嘌呤和嘧啶核苷酸的從頭合成和補(bǔ)救途徑以及組氨酸和色氨酸的合成。在人體中，PRS基因的多種突變形式與人的許多神經(jīng)性疾病相關(guān)，但是其致病機(jī)理尚不清楚。由于構(gòu)巢曲霉是多細(xì)胞真核生物，在同緣關(guān)系上較單細(xì)胞的酵母與人類的同源關(guān)系更為接近，且具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、遺傳背景清楚、遺傳可

2、操作性強(qiáng)等特征，因此常被用來(lái)作為研究與人類疾病相關(guān)基因功能的重要模式生物。本研究以構(gòu)巢曲霉為模式生物研究PRS蛋白家族在細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中的功能。
　　已有研究表明釀酒酵母中的PRS蛋白家族在釀酒酵母中存在5個(gè)同源蛋白，且以形成兩個(gè)功能互補(bǔ)的復(fù)合體的形式發(fā)揮作用，通過(guò)同源比對(duì)(BLAST)，我們發(fā)現(xiàn)在構(gòu)巢曲霉中存在三個(gè)PRS蛋白的同源蛋白。根據(jù)它們與釀酒酵母PRS1-5蛋白的同源關(guān)系，我們將其命名為AnPRS1，AnPRS2和AnPR

3、S3。其中AnPRS2這個(gè)蛋白與人類疾病相關(guān)蛋白PRPS1(HomoSapiens)的同—性(idendity)高達(dá)66.7％，且包含所有與疾病相關(guān)的突變位點(diǎn)。
　　在我們實(shí)驗(yàn)室前期篩選構(gòu)巢曲霉控制胞質(zhì)分裂的SIN途徑(SeptationInitiation Network)的反向調(diào)節(jié)子的研究中也發(fā)現(xiàn)，構(gòu)巢曲霉中PRS酶活力的降低可以抑制SIN途徑下游關(guān)鍵激酶SEPH的缺失表型。
　　我們對(duì)編碼這三個(gè)蛋白的基因分別進(jìn)行敲除和

4、啟動(dòng)子替換實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Anprs1的敲除或抑制表達(dá)對(duì)菌絲的生長(zhǎng)發(fā)育影響不大，但是對(duì)Anprs2或Anprs3的敲除或抑制表達(dá)均會(huì)導(dǎo)致構(gòu)巢曲霉孢子不能萌發(fā)，表現(xiàn)出致死基因的表型。此外，在構(gòu)巢曲霉的不同生長(zhǎng)階段關(guān)閉Anprs1，2，3發(fā)現(xiàn)，ANPRS2在菌絲的整個(gè)生長(zhǎng)階段都是必需的，而Anprs1和Anprs3在菌絲生長(zhǎng)階段的關(guān)閉都不會(huì)對(duì)菌株發(fā)育產(chǎn)生影響。我們通過(guò)條件啟動(dòng)子高表達(dá)Anprs1，2,3發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)Anprs2會(huì)導(dǎo)致胞質(zhì)分裂的失敗

5、以及產(chǎn)孢不能發(fā)生，高表達(dá)Anprs3和Anprs1均會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)孢和胞質(zhì)分裂的一定缺陷。
　　為了進(jìn)一步弄清楚AnPRS1，2，3三個(gè)蛋白的細(xì)胞學(xué)功能，我們分別測(cè)定了抑制三個(gè)蛋白表達(dá)情況下的PRS酶活，發(fā)現(xiàn)這三個(gè)蛋白對(duì)酶活的貢獻(xiàn)是不同的，在抑制ANPRS2表達(dá)的情況下，PRS總酶活只有野生型的5％，而抑制ANPRS3表達(dá)，其PRS總酶活是野生型的25％，抑制ANPRS1表達(dá)可使酶活維持在野生型的80％。實(shí)時(shí)定量PCR(Real-tim

6、e-qPCR)結(jié)果顯示Anprs1，2,3這三個(gè)基因的表達(dá)水平在菌絲的生長(zhǎng)階段也不同，以Anprs2的表達(dá)水平最高，Anprs3次之，Anprs1最少。這些結(jié)果都建議Anprs2在構(gòu)巢曲霉的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中扮演著最為重要的角色。
　　綜上所述，AnPRS2作為人類疾病相關(guān)蛋白HumanPRPS1的同源蛋白，在構(gòu)巢曲霉的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中同樣發(fā)揮著重要作用，對(duì)其抑制和高表達(dá)情況下的細(xì)胞學(xué)表型分析，將有助于我們理解因?yàn)槿祟怭RPS1突變而造