日本血吸蟲無機焦磷酸酶(SjPPase)的結(jié)構(gòu)功能研究.pdf

1、背景：無機焦磷酸酶（Inorganic pyrophosphatase, PPase）是一類催化無機焦磷酸鹽(PPi)水解生成磷酸鹽的蛋白質(zhì)。PPi是生物大分子（如DNA，RNA，蛋白質(zhì)和糖原等）生物合成過程的副產(chǎn)物，PPi的水解反應將在熱力學上促進生物大分子的合成。另外，PPi也是硫酸鹽還原反應的一個產(chǎn)物，PPi的水解反應促進了硫酸鹽的利用，為半胱氨酸、及甲硫氨酸等的合成提供硫源。
　　目的：建立日本血吸蟲無機焦磷酸酶重組表達與

2、純化方法，研究其分子性質(zhì)并解析其晶體結(jié)構(gòu)，為闡明其結(jié)構(gòu)功能關(guān)系、研究其在血吸蟲病防治上的應用奠定堅實的基礎。
　　方法：分子克隆SjPPase基因至pET-28a質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒導入大腸桿菌BL21（DE3），IPTG誘導表達SjPPase重組蛋白；超聲裂解菌體，上清經(jīng)6×His-Tag特異性結(jié)合Ni-NTA柱與弱陰離子DEAE柱兩步分離、純化獲取高純度蛋白。使用比色法測定反應產(chǎn)物磷酸鹽（Pi）在不同時間的濃度來計算SjPPase

3、的酶學活性，以及抑制劑的抑制活性。利用Cross-linking反應對SjPPase溶液狀態(tài)下的聚集行為進行研究；采用Native-PAGE電泳探索SjPPase與一些小分子之間的相互作用。運用ELISA法測定SjPPase作為血吸蟲病診斷抗原的敏感性和特異性。應用氣液擴散法進行SjPPase蛋白酶的晶體生長并收集其X-Ray衍射數(shù)據(jù)，解析并分析其晶體結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)果：制備得到了純度較高（>95％）的SjPPase重組蛋白；測定了

4、其不同溫度和pH時的酶學活性，其中最適溫度和pH分別在60℃和7.0附近；測定了抑制劑NaF，MDP以及IDP的抑制活性，它們的半抑制濃度IC50依次為1.92mM、3.72mM和4.97mM；在溶液狀態(tài)下，SjPPase分子是以二聚體聚集形成的多聚體形式存在；研究結(jié)果顯示，Mg2+和SjPPase分子中的半胱氨酸對于維持SjPPase結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性非常重要，在SjPPase分子中存在底物結(jié)合的非活性中心位點；解析并分析了SjPPase的