鈣調(diào)磷酸酶對(duì)球孢白僵菌生物學(xué)特性影響.pdf

1、昆蟲病原真菌是自然界控制害蟲的重要因素之一，在害蟲生物防治中具有廣闊的應(yīng)用前景。但是作為一類重要的生防劑，昆蟲病原真菌自身也存在擊倒害蟲時(shí)間過長(zhǎng)和防效不穩(wěn)定等缺點(diǎn)，使得其廣泛使用受到限制。主要原因在于，人們對(duì)昆蟲病原真菌侵染致病的分子機(jī)理研究較為薄弱，在實(shí)際應(yīng)用中缺乏系統(tǒng)的理論指導(dǎo)。因此，加強(qiáng)昆蟲病原真菌侵染致病的分子機(jī)理研究，對(duì)促進(jìn)真菌殺蟲劑產(chǎn)業(yè)具有重要意義。 鈣調(diào)磷酸酶(Calicineurin，CN)是一種高度保守的Ser

2、/Thr蛋白磷酸酶，其氨基酸序列從酵母到人類均具有較高的同源性。目前，鈣調(diào)磷酸酶被認(rèn)為是生物體應(yīng)激反應(yīng)時(shí)的中心調(diào)節(jié)蛋白，并與真菌的孢子及菌絲形態(tài)、調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)陽離子平衡平衡、細(xì)胞壁的合成以及病原真菌致病性等相關(guān)。因此，鈣調(diào)磷酸酶介導(dǎo)的信號(hào)途徑是揭示真菌相關(guān)生物學(xué)性狀分子機(jī)理的重要線索。然而，鈣調(diào)磷酸酶在昆蟲病原真菌中的功能，目前尚無相關(guān)報(bào)道。 本論文以國內(nèi)外廣泛用于害蟲生物防治的昆蟲病原真菌球孢白僵菌(Beauveria bass

3、iana)為材料，利用同源克隆分離了與構(gòu)巢曲霉、稻瘟病菌鈣調(diào)磷酸酶催化A亞基編碼基因CNA同源基岡BCNA，并通過超量表達(dá)和反義抑制BCNA研究了鈣調(diào)磷酸酶與球孢白僵菌發(fā)育分化、侵染致病以及逆境適應(yīng)性調(diào)節(jié)等的關(guān)系，為探討鈣調(diào)磷酸酶在昆蟲病原真菌球孢白僵菌中的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。 1.CNA同源基因BCNA的克隆與特征分析 在分析多種絲狀真菌CNA同源蛋白保守氨基酸序列的基礎(chǔ)上，通過簡(jiǎn)并PCR和YADE等方法，從球孢白僵菌

4、中克隆得到一個(gè)CNA編碼基因，命名為BCNA(GenBank登錄號(hào)：EU386769)。通過3'RACE克隆了BCNA的cDNA序列。序列分析表明，BCNA含有3個(gè)內(nèi)含子，編碼525個(gè)氨基酸，推測(cè)分子量為60 kDa，等電點(diǎn)為6.04。BCNA推測(cè)氨基酸序列與來源于禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)，粗糙脈孢霉(Neurospora crassa)，稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)和構(gòu)巢曲霉(Aspe

5、rgillus nidulans)等CNA高度同源，相似性分別為87％、87％、85％和82％，并且具有保守的鈣調(diào)磷酸酶B亞基(調(diào)節(jié)亞基)結(jié)合域、鈣調(diào)素結(jié)合域以及白抑制區(qū)域。Southern雜交顯示，BCNA基因在球孢白僵菌中以單拷貝形式存在。 2.BCNA基因的表達(dá)分析 利用Real-Time RT-PCR分析了BCNA基因的表達(dá)特性。結(jié)果顯示，球孢白僵菌在高溫(32℃)、高滲(0.5 M NaCl)以及昆蟲體壁誘導(dǎo)條

6、件下，BCNA表達(dá)水平均明顯升高，且表達(dá)水平隨誘導(dǎo)時(shí)間的變化趨勢(shì)存在差異。在昆蟲體壁為唯一營養(yǎng)源的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)12hr的BCNA表達(dá)水平最高。由此推測(cè)，BCNA可能參與病原菌的逆境適應(yīng)性調(diào)節(jié)，并且與球孢白僵菌寄生生長(zhǎng)相關(guān)。 3.BCNA基因的功能分析 為進(jìn)一步明確BCNA在球孢白僵菌中的生物學(xué)功能，利用超量表達(dá)和反義抑制BCNA基因，分析了BCNA與菌株發(fā)育分化、侵染致病以及逆境適應(yīng)性調(diào)節(jié)等的關(guān)系。主要結(jié)果如下：

7、 BCNA對(duì)球孢白僵菌分生孢子的產(chǎn)生、活力以及菌落形態(tài)無明顯影響。生物學(xué)特性分析表明，反義抑制和超量表達(dá)BCNA對(duì)球孢白僵菌產(chǎn)孢量、萌發(fā)率無顯著影響。在正常培養(yǎng)條件，高滲(0.8M NaCl)、酸性(pH5.0)、堿性(pH9.0)以及高溫(32℃)等培養(yǎng)條件下，超量表達(dá)和反義抑制BCNA轉(zhuǎn)化子菌落形態(tài)與野生菌株無明顯差異。但在氧化環(huán)境(含0.05％H2O2的CZP)下，超量表達(dá)BCNA轉(zhuǎn)化子菌落生長(zhǎng)速率顯著小于野生菌株，推測(cè)BCN

8、A可能參與昆蟲病原真菌球孢白僵菌對(duì)氧化環(huán)境的適應(yīng)性調(diào)節(jié)。 BCNA影響球孢白僵菌對(duì)殺真菌劑咯菌腈的敏感性。研究表明，反義抑制BCNA降低了球孢白僵菌對(duì)殺真菌劑咯菌腈的敏感性，轉(zhuǎn)化子對(duì)殺真菌劑咯菌腈產(chǎn)生明顯抗性。超量表達(dá)BCNA的轉(zhuǎn)化子和野生菌株相同，對(duì)咯菌腈敏感。由此表明，鈣調(diào)磷酸酶信號(hào)途徑參與球孢白僵菌對(duì)殺真菌劑咯菌腈敏感性調(diào)節(jié)。 BCNA影響球孢白僵菌致病性。生物測(cè)定表明，反義抑制BCNA降低了球孢白僵菌對(duì)桃蚜的毒力

9、。在1×107孢子/ml濃度下，反義抑制BCNA的轉(zhuǎn)化子對(duì)桃蚜的致死中時(shí)比野生菌株延長(zhǎng)7.4 hr，而超量表達(dá)BCNA對(duì)球孢白僵菌毒力無明顯差異。由此表明，BCNA對(duì)球孢白僵菌毒力有一定的影響。 BCNA影響球孢白僵菌昆蟲體壁水解酶編碼基因Prl和疏水蛋白編碼基因Hyd2的表達(dá)。RT-PCR結(jié)果顯示，在昆蟲體壁誘導(dǎo)條件下，反義抑制BCNA菌株的昆蟲體壁水解酶編碼基因Prl表達(dá)水平在24 hr明顯低丁野生型菌株；在PDA上培養(yǎng)菌株