基因芯片技術(shù)在心血管研究中的應(yīng)用

1、基因芯片技術(shù)在心血管研究中的應(yīng)用,綠色包裝與生物納米技術(shù)實(shí)驗(yàn)室,第一節(jié) 基因芯片技術(shù)概論,一、基因芯片技術(shù)的產(chǎn)生和發(fā)展二、基因芯片技術(shù)概論三、基因芯片制備技術(shù)四、基因芯片的檢測(cè)方法,一、基因芯片技術(shù)的產(chǎn)生和發(fā)展,1986 Dulbecco在《Science》撰文 “腫瘤研究的轉(zhuǎn)折點(diǎn):人類(lèi)基因組的測(cè)序”，提出全面解讀人類(lèi)基因組序列。1990.10 美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究機(jī)構(gòu)率先啟動(dòng)人類(lèi)基因組計(jì)劃 實(shí)驗(yàn)

2、方法和技術(shù)的產(chǎn)生 2003.4 人類(lèi)基因組計(jì)劃完成 后基因組時(shí)代,,,傳統(tǒng)的方法：效率太低，無(wú)法滿(mǎn)足后基因組研究的要求高效研究成千上萬(wàn)基因的功能需要高效的方法和工具,生物芯片技術(shù)始于20世紀(jì)80年代后期，將八聚體寡核苷酸探針固定在尼龍膜上進(jìn)行雜交， 但由于核酸在尼龍膜上容易擴(kuò)散，因此在單位面積上的點(diǎn)樣密度受到限制。同時(shí)濾膜面積較大而需要較多的探針量，故檢測(cè)靈敏度較低，為了提高點(diǎn)樣密度和靈敏

3、度，降低探針用量，人們逐漸發(fā)現(xiàn)以玻璃、硅片等材料比傳統(tǒng)的膜載體有無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)，因此以此為材料的DNA芯片技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。,基因芯片發(fā)展歷史,1991年，美國(guó)Affymetrix公司在玻璃片上原位合成世界上第一張寡核苷酸基因芯片。1995年，Stanford大學(xué)的P.Brown實(shí)驗(yàn)室發(fā)明了第一塊以玻璃為載體的世界上第一張直接點(diǎn)樣法制備的cDNA芯片。,基因芯片發(fā)展歷史,1996 Chee et al：DNA測(cè)序1996 Cr

4、onin et al：突變檢測(cè)1996 Sapolsley & Lipshutz：基因圖克隆1996 Shalon et al：復(fù)雜DNA樣本分析1996 Shoemaker et al：缺省突變定量表型分析目前擴(kuò)展的方法，包括蛋白芯片、組織芯片等,乳腺癌診斷組織芯片,蛋白質(zhì)芯片示意圖,,Southern & Northern Blot,,,Dot Blot,Macroarray,Microar

5、ray,,,,,二、基因芯片技術(shù)概論,（一）基因芯片的概念 通過(guò)微陣列技術(shù)將大量特定的基因片段或寡核苷酸片段作為探針有序地和高密度地排列固定于玻璃或硅等載體上，然后與待測(cè)的有熒光標(biāo)記的樣品核酸按堿基配對(duì)的原理進(jìn)行雜交，通過(guò)激光共聚焦系統(tǒng)檢測(cè)雜交信號(hào)強(qiáng)度。經(jīng)計(jì)算機(jī)分析處理數(shù)據(jù)資料，獲取樣品數(shù)量和序列信息，從而可對(duì)核酸序列進(jìn)行大規(guī)模、高通量的研究技術(shù)。,基因芯片原型,（二）基因芯片的工作原理

6、 基因芯片的工作原理是根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)的原理，標(biāo)記的待測(cè)樣本DNA與芯片上特定位置的探針雜交，通過(guò)分析處理芯片的雜交檢測(cè)圖像確定靶DNA序列，這樣就可對(duì)細(xì)胞和組織中大量的基因信息進(jìn)行分析。,三、基因芯片制備技術(shù),（一）原位合成的芯片 基于組合化學(xué)的合成原理，它通過(guò)一組定位模板來(lái)決定基片表面上不同化學(xué)單體的偶聯(lián)位點(diǎn)和次序。 在片合成法制備DNA芯片的關(guān)鍵是高空間分辨率的模板定位技術(shù)和固相合成化學(xué)技術(shù)的精巧

7、結(jié)合。,原位合成方法的工作原理,Affymetrix公司研究組首次報(bào)道和采用合成高密度基因芯片,（二）直接點(diǎn)樣法 首先按常規(guī)方法制備cDNA（或寡核苷酸）探針庫(kù)，然后通過(guò)特殊的針頭和微噴頭, 分別把不同的探針溶液，逐點(diǎn)分配在玻璃、尼龍或者其它固相基底表面上不同位點(diǎn),并通過(guò)物理和化學(xué)的結(jié)合使探針被固定于芯片的相應(yīng)位點(diǎn)。,1. 探針的準(zhǔn)備 根據(jù)實(shí)驗(yàn)的目的，選擇相應(yīng)的探針及種類(lèi)，基因芯片的探針主要有寡核苷酸或cDNA。

8、 對(duì)于寡核苷酸探針，探針的設(shè)計(jì)是很關(guān)鍵的一個(gè)環(huán)節(jié)，需要根據(jù)研究目的設(shè)計(jì)相應(yīng)的探針序列，如SNP分析芯片，必須考慮待檢測(cè)位點(diǎn)的序列和位置，需要嚴(yán)格控制探針的Tm值。如果用于表達(dá)譜的研究，目的基因的寡核苷酸探針設(shè)計(jì)原則是盡量使探針與其他基因之間沒(méi)有同源性，即探針的特異性要好。,對(duì)于cDNA芯片，需要預(yù)先克隆到大量目的基因的cDNA克隆，并經(jīng)過(guò)測(cè)序驗(yàn)證。用PCR進(jìn)行探針的擴(kuò)增，經(jīng)過(guò)純化后，即可用于點(diǎn)樣。,2．玻片的表面修飾

9、對(duì)于DNA芯片，點(diǎn)樣法所用載體多為玻璃片 在點(diǎn)樣前，一般先對(duì)載體表面進(jìn)行化學(xué)修飾(如多聚賴(lài)氨酸或硅烷偶聯(lián)劑等)，使其表面富含氨基并帶正電。修飾后的固相載體表面可利用靜電吸附帶負(fù)電的DNA探針，或通過(guò)雙功能偶聯(lián)試劑(如戊二醛)輔助形成共價(jià)化學(xué)鍵而連接。,3．點(diǎn)樣 (1)點(diǎn)樣系統(tǒng)：點(diǎn)樣系統(tǒng)又叫點(diǎn)樣儀或機(jī)械手。在直接點(diǎn)樣法中，采用的機(jī)械手有一套計(jì)算機(jī)控制的三維移動(dòng)裝置，包括裝點(diǎn)樣針的點(diǎn)樣頭、機(jī)械手臂、點(diǎn)樣針清洗系統(tǒng)、芯片載片

10、臺(tái)及計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)。,點(diǎn)樣方式包括接觸式點(diǎn)樣(針點(diǎn))和非接觸式點(diǎn)樣(噴點(diǎn))。 針點(diǎn)是指用針通過(guò)直接接觸介質(zhì)表面將DNA樣品點(diǎn)到介質(zhì)上。 噴點(diǎn)是通過(guò)非接觸式方式將DNA樣品點(diǎn)到介質(zhì)表面，通常是用加壓的方法傳遞探針 。,針點(diǎn)法,,噴點(diǎn)法,,2)點(diǎn)樣與點(diǎn)樣后處理： 通常情況下，點(diǎn)樣后處理包括水合、紫外交聯(lián)、洗脫和封閉4個(gè)步驟。 水合的目的是保證樣品與基片表面在溶液狀態(tài)下充分反應(yīng)。 紫外交聯(lián)的目的則是

11、讓樣品與基片表面形成的化學(xué)鍵能夠吸收紫外線(xiàn)而變得更加牢固。,洗脫的目的是為了洗掉那些沒(méi)有牢固結(jié)合的樣品，以消除其在雜交過(guò)程中的影響。 封閉則是為了消除基片表面活性基團(tuán)與雜交液中的探針?lè)肿又g的非專(zhuān)一性相互作用而產(chǎn)生背景。,四、基因芯片的檢測(cè)方法,（一）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)1.確定研究目標(biāo)RNA檢測(cè)：基因表達(dá)水平的研究DNA檢測(cè)：SNP或突變分析、基因拷貝數(shù)研 究及DNA甲基化研究,2. 樣本

12、選擇和設(shè)計(jì)(1)待測(cè)樣本的選擇：可以是組織來(lái)源的或血液來(lái)源的，也可以是培養(yǎng)的細(xì)胞或病人的體外分泌物等。(2)對(duì)照樣本的選擇：組織表達(dá)譜芯片一般選用正常的相同組織與病例組織作為對(duì)照。,基因芯片技術(shù)流程,（二）檢測(cè)原理1. 用于RNA水平的大規(guī)?；虮磉_(dá)譜的研究 由于基因芯片在固定介質(zhì)和標(biāo)記染料方面的優(yōu)勢(shì)，可以實(shí)現(xiàn)同一張芯片上多種熒光標(biāo)記。利用雙色熒光系統(tǒng)，可以在一張芯片上實(shí)現(xiàn)待測(cè)樣本和對(duì)照樣本靶序列的同

13、時(shí)檢測(cè)。,,基因芯片對(duì)基因表達(dá)譜的分析,2. 檢測(cè)DNA的結(jié)構(gòu)及組成 基因芯片可以從不同的方面對(duì)DNA進(jìn)行檢測(cè)，如DNA的測(cè)序和再測(cè)序、DNA的甲基化檢測(cè)、基于芯片的比較基因組雜合(CGH)技術(shù)等,第二節(jié) 基因芯片在心血管疾病基因組 學(xué)研究中的應(yīng)用,一、基因芯片技術(shù)與心血管疾病致病基因或遺傳易感性研究(一) 遺傳標(biāo)記（genetic marker ） 是指可遺傳的并可檢測(cè)的DNA序列,第一代遺傳標(biāo)記：限制性片段

14、長(zhǎng)度多態(tài)(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)檢測(cè)DNA在限制性?xún)?nèi)切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。凡是可以引起酶切位點(diǎn)變異的突變?nèi)琰c(diǎn)突變（新產(chǎn)生和去除酶切位點(diǎn)）和 一段DNA的重新組織（如插入和缺失造成酶切位點(diǎn)間的長(zhǎng)度發(fā)生變化）等均可導(dǎo)致RFLP的產(chǎn)生。,限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性,第二代遺傳標(biāo)記：微衛(wèi)星標(biāo)記（microsatellite，MS)　 又稱(chēng)為短串聯(lián)重復(fù)序列(s

15、imple tandem repeats，STRs)或簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeats） 是均勻分布于真核生物基因組中的簡(jiǎn)單重復(fù)序列，由2～6個(gè)核苷酸的串聯(lián)重復(fù)片段構(gòu)成，由于重復(fù)單位的重復(fù)次數(shù)在個(gè)體間呈高度變異性并且數(shù)量豐富，因此微衛(wèi)星標(biāo)記的應(yīng)用非常廣泛。,,微衛(wèi)星標(biāo)記,第三代遺傳標(biāo)志：?jiǎn)魏塑账岫鄳B(tài)性標(biāo)（single nucleotide polymorphism, SNP） 主要是指在

16、基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。,42,1….ATCCTGTACCTACGTGTACAATAGTA…..CTGATCATCTCTATGGG….2….ATCCTGTTCCTACGTGTACAATAGTA….. CTGATCATCTCTATGGG….3….ATCCTGTACCTACGTGTACAATAGTA…..CTGATCAGCTCTATGGG….,1,2,3,,,SNP1,SNP2,單核苷酸多態(tài)性（SNPs）

17、,SNP作為遺傳標(biāo)記的優(yōu)勢(shì)（1）SNP數(shù)量多，分布廣泛，人類(lèi)30億堿基中共有300萬(wàn)以上的SNPs 。（2）SNP適于快速、規(guī)?；Y查。 SNP一般只有兩種堿基組成，所以它是一種二態(tài)的標(biāo)記。 （3）SNP直接影響或決定疾病的發(fā)生。 研究SNP可以預(yù)測(cè)個(gè)人患病可能性，以及疾病預(yù)后、對(duì)藥物作用的有效性,（二）Haplotype Map（ HapMap）計(jì)劃 單體型是指相鄰S(chǎng)NPs的等位位點(diǎn)傾向于以一個(gè)整體遺傳給后

18、代。位于染色體上某一區(qū)域的一組相關(guān)聯(lián)的SNP等位位點(diǎn)的集合。,2002年10月28日，HapMap計(jì)劃正式啟動(dòng)。這一項(xiàng)目旨在構(gòu)建整個(gè)人類(lèi)基因組DNA序列中多態(tài)位點(diǎn)的常見(jiàn)模式，至少對(duì)100萬(wàn)個(gè)SNP進(jìn)行全基因組規(guī)模的基因分型。,HapMap的構(gòu)建分為三個(gè)步驟：（a）在多個(gè)個(gè)體的DNA樣品中鑒定單核苷酸多態(tài)性（SNPs）；（b）將群體中頻率大于1%的那些共同遺傳的相鄰S(chǎng)NPs組合成單體型；（c）在單體型中找出用于識(shí)別這些單體型的標(biāo)簽S

19、NPs。通過(guò)對(duì)標(biāo)簽SNPs進(jìn)行基因分型，研究者可以確定每個(gè)個(gè)體擁有的單體型。,（三）致病基因的遺傳易感性研究,1. 群體關(guān)聯(lián)分析,2. 家系連鎖分析,（四）基因芯片技術(shù)是遺傳分析的主要手段2007年Samani 等應(yīng)用Affymetrix 500K SNP芯片, 對(duì)德國(guó)人心肌梗死家庭研究(GerMI)中875例心肌梗死病例和1644名對(duì)照進(jìn)行基因型檢測(cè),發(fā)現(xiàn)了除9p21區(qū)域的位點(diǎn)rs1333049外的6個(gè)與冠心病顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)。,Ｈ

20、aley等利用含8600個(gè)ｃDNA/EST的微陣列，對(duì)腫瘤壞死因子刺激的人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞及粥樣硬化的主動(dòng)脈進(jìn)行了檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)新的化學(xué)因子eotaxin及其受體CCR3的表達(dá)與動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系極其密切 。,二、基因芯片技術(shù)與心血管疾病轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究 對(duì)來(lái)源于不同個(gè)體、不同組織、不同細(xì)胞周期、不同發(fā)育階段、不同分化階段、不同病變、不同刺激（包括不同誘導(dǎo)、不同治療階段）下的細(xì)胞內(nèi)的mRNA或逆轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生的cDNA與表達(dá)

21、譜基因芯片進(jìn)行雜交，可以對(duì)這些基因表達(dá)的個(gè)體特異性、組織特異性、發(fā)育階段特異性、分化階段特異性、病變特異性、刺激特異性進(jìn)行綜合的分析和判斷，迅速將某個(gè)或幾個(gè)基因與疾病聯(lián)系起來(lái)，極大地加快這些基因功能的確立，同時(shí)進(jìn)一步研究基因與基因間相互作用的關(guān)系。,總體的研究思路:利用表達(dá)譜芯片技術(shù)鑒定出參與疾病發(fā)展過(guò)程中的關(guān)鍵的基因表達(dá)，然后通過(guò)基因功能的各種研究方法如基因敲除、中和抗體等技術(shù)來(lái)證明關(guān)鍵基因在疾病發(fā)生、發(fā)展中的功能。,Rysa等 以含

22、4 000個(gè)CDNA/表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)微陣列檢測(cè)自發(fā)性高血壓引起的進(jìn)行性左心室肥大小鼠心室基因表達(dá)，證實(shí)了進(jìn)行性左心室肥大與收縮蛋白和利鈉肽基因的表達(dá)增高有關(guān)。并對(duì)20個(gè)月和12個(gè)月的自發(fā)性高血壓小鼠心室基因表達(dá)進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)了有92個(gè)已知基因和35個(gè)EST表達(dá)有差異，其中的上調(diào)基因主要編碼細(xì)胞結(jié)構(gòu)和信號(hào)蛋白，大多數(shù)的下調(diào)基因則編碼與脂肪酸和能量代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)。,Litvin等通過(guò)下腔靜脈造瘺造成小鼠因體積負(fù)荷而導(dǎo)致心肌肥大，

23、用Afymetrix基因表達(dá)芯片檢測(cè)心肌中PLF基因家族的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)在心肌肥大的過(guò)程中其表達(dá)水平升高，而通過(guò)手術(shù)降低負(fù)荷后其表達(dá)水平則下降，表明心肌肥大的發(fā)展與PLF基因家族的表達(dá)水平有關(guān)，從而為心肌肥大的基因治療提供了可能。,三、基因芯片技術(shù)與心血管疾病藥物基因組學(xué)研究,（一）藥理研究中的應(yīng)用 推測(cè)藥物作用機(jī)制及靶點(diǎn)（二）毒理研究中的應(yīng)用,四、基因芯片技術(shù)與心血管疾病個(gè)性化用藥研究

24、,（一）高血壓的藥物個(gè)性化治療1.AGT基因多態(tài)性與降壓療效：用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制(ACEI)卡托普利、依那普利、賴(lài)諾普利和培垛普利研究的抗高血壓藥物療效，發(fā)現(xiàn)T/T、T/M基因型患者治療后的血壓下降比M/M基因型患者顯著。2.ACE基因多態(tài)性與降壓療效: 福辛普利降低收縮壓及舒張壓的作用，在D/D基因型高血壓患者較I/I型、I/D型患者更明顯 。,3. ATR基因多態(tài)性與降壓療效：AT1 R基因多態(tài)性(A1166C)與ACEI類(lèi)

25、藥物的降壓療效相關(guān)，且此相關(guān)性在老年患者和超體重患者中尤為明顯。4.利尿藥的療效: ACE和α-adducin的基因多態(tài)性對(duì)利尿藥的降壓效果有影響；同時(shí)攜帶ACE的I型等位基因及α-adducin的Trp460等位基因的患者，氫氯噻嗪的療效最好。而攜帶ACE的D/D等位基因及α-adducin的Gly/Trp等位基因的患者，治療后血壓下降最少。所以聯(lián)合分析ACE和α-adducin的兩個(gè)基因多態(tài)性有助于預(yù)測(cè)利尿劑的療效。,(二)脂質(zhì)代

26、謝異常的藥物個(gè)性化治療 1.影響藥代動(dòng)力學(xué)的基因變異 在藥物代謝酶中,CYP2D6 及CYP2C9 的基因多態(tài)性對(duì)藥物治療的療效及不良反應(yīng)的影響受到廣泛關(guān)注。如根據(jù)CYP2D6 基因的多態(tài)性將患者分為3種類(lèi)型即弱代謝者、正常代謝者和超速代謝者。弱代謝者1d僅需給藥1次就能維持藥效,而且不用給予緩釋制劑，而超速代謝者就必須縮短給藥間隔。,2.脂類(lèi)代謝等基因的變異 載脂蛋白E 的基因型能影響降血脂藥苯扎貝特的降血脂作用