家蠶BmRunx蛋白家庭的鑒定以及對血細(xì)胞分化調(diào)控的研究.pdf

1、Runx轉(zhuǎn)錄因子家族在多細(xì)胞生物的發(fā)育中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，哺乳動物中有3個Runx轉(zhuǎn)錄因子:Runx1，Runx2和Runx3，它們在干細(xì)胞維持、增殖分化和骨形成中發(fā)揮重要作用。昆蟲中，Runx家族研究也取得一定的進(jìn)展，果蠅中有4個Runx基因，分別是run、lozenge、 CG34145和CG42267，其中run在性別決定和神經(jīng)形成中扮演重要角色;lozenge在觸角和眼睛的生成中起著至關(guān)重要的作用，并且與GATA因子Srp(

2、Serpent)以及Gcm(Glial cell missing)在果蠅胚胎時期造血作用中共同調(diào)控結(jié)晶細(xì)胞的形成。
　　家蠶作為鱗翅目昆蟲的代表，隨著其基因組圖譜繪制的完成，已經(jīng)逐步成為基因功能研究的理想模型。家蠶有五種血細(xì)胞類型，但各種血細(xì)胞在體內(nèi)的形成過程及其調(diào)控機(jī)制仍不清楚。本論文基于家蠶基因組數(shù)據(jù)庫，對家蠶Runx轉(zhuǎn)錄因子家族進(jìn)行克隆和鑒定，并對其表達(dá)情況進(jìn)行分析。最后重點(diǎn)對Bmlozenge(BGIBMGA008908)

3、進(jìn)行進(jìn)一步的研究，揭示其在血細(xì)胞免疫反應(yīng)，特別是黑化反應(yīng)的功能。主要研究結(jié)果如下:
　　1.家蠶BmRunx家族的鑒定
　　利用家蠶基因組數(shù)據(jù)庫，對BmRunx家族進(jìn)行分析和鑒定，發(fā)現(xiàn)有3個BmRunx基因家族成員。利用RACE技術(shù)，獲得其完整的cDNA序列。該基因家族定位于3號染色體，具有典型的Runt結(jié)構(gòu)域。對昆蟲Runx家族序列進(jìn)行聚類分析結(jié)果顯示，Runx家族共聚為4類，分別是run、lozenge、CG34145和

4、CG42267。BmRunx家族三個基因BGIBMGA008906(Bm8906)、BGIBMGA008908(Bm8908)和BGIBMGA008970(Bm8970)分別屬于run、lozenge和CG34145。
　　2.家蠶BmRunx家族的表達(dá)分析
　　利用PCR技術(shù)檢測BmRunx家族在胚胎時期的表達(dá)情況，結(jié)果顯示Bm8906和Bm8908主要表達(dá)于胚胎1天和2天，而Bm8970主要在家蠶的胚胎4天和5天高表達(dá)。

5、BmRunx家族成員表達(dá)模式的差異表明各成員可能扮演著不同的角色。家蠶5齡3天芯片數(shù)據(jù)及各組織表達(dá)分析結(jié)果顯示，Bm8906和Bm8970分別高表達(dá)于卵巢和精巢，而Bm8908主要在血液和翅原基（造血器官）中表達(dá)。暗示Bm8908可能在造血作用中扮演著重要的調(diào)控功能。聚類分析結(jié)果顯示，Bm8908和果蠅lozenge聚為一類，具有很高的同源性，而果蠅lozenge主要調(diào)控結(jié)晶細(xì)胞的分化。綜上所述，推測Bm8908在結(jié)晶細(xì)胞的分化中發(fā)揮著

6、重要的作用。對Bm8908(Bmlozenge)的鑒定、克隆和表達(dá)分析，為其在造血調(diào)控中的功能研究奠定基礎(chǔ)。
　　3.家蠶Bmlozenge抗體的制備
　　Bmlozenge(Bm8908)的ORF為1305bp，編碼434aa的蛋白，預(yù)測蛋白的等電點(diǎn)6.27，分子量48.3KDa。通過家蠶數(shù)據(jù)庫比對，選取Bmlozenge編碼框中較為特異231aa長度的片段，原核表達(dá)，純化蛋白，免疫小鼠制備免疫血清，最終獲得了Bmloze

7、nge小鼠多克隆抗體。ELISA檢測其效價(jià)為1∶20000，Western blotting檢測獲得的條帶大小約為50KDa，與Bmlozenge預(yù)測的蛋白分子量一致。免疫熒光顯示其在循環(huán)血液部分細(xì)胞中表達(dá)，與DAPI共染發(fā)現(xiàn)其主要位于細(xì)胞核。
　　4.家蠶Bmlozenge的RNAi
　　通過RT-PCR檢測家蠶Bmlozenge在血液各時期的表達(dá)情況，結(jié)果顯示Bmlozenge主要在家蠶盛食期高量表達(dá)，特別是4齡3天和5

8、齡3天。利用T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒，成功合成Bmlozenge的RNAi雙鏈。5齡1天注射家蠶體內(nèi)，72h取血觀察血液黑化速率，并收集血細(xì)胞提取RNA，RT-PCR檢測Bmlozenge的表達(dá)，結(jié)果顯示Bmlozenge下調(diào)后黑化速度變緩。RNAi結(jié)果表明Bmlozenge可能參與家蠶免疫反應(yīng)，尤其是黑化途徑，推測Bmlozenge可能與擬絳色細(xì)胞的發(fā)育相關(guān)。
　　5.家蠶Bmlozenge在果蠅S2細(xì)胞系和蠶體過表達(dá)
　　成功

9、構(gòu)建Bmlozenge過表達(dá)載體。首先在體外果蠅S2細(xì)胞系中過表達(dá)Bmlozenge。結(jié)果顯示Bmlozenge過表達(dá)后，果蠅黑化效應(yīng)因子ppo1、ppo2和ppo3都顯著上調(diào)。表明Bmlozenge可以啟動果蠅ppo的表達(dá)。在家蠶體內(nèi)過表達(dá)Bmlozenge后，家蠶血液黑化速度加快，黑化效應(yīng)因子ppo1和它的上游激酶baee和paee表達(dá)量升高，表明家蠶Bmlozenge因子與黑化作用相關(guān)，推測Bmlozenge是通過調(diào)控?cái)M絳色來實(shí)現(xiàn)