MicroRNA-144真核表達載體的構(gòu)建以及對紅系分化調(diào)控的研究.pdf

1、造血是人體最重要的生理過程之一，造血過程必須被精確的控制以滿足人體正常的生理需求，它涉及造血干細胞的自我更新、定向分化成各鏈系祖細胞并繼續(xù)分化發(fā)育成多種具有不同形態(tài)和功能的成熟血細胞。紅系分化是其中重要的分支。
　　 MicroRNAs(miRNAs)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一類非編碼的調(diào)節(jié)性RNA分子，己被認為是多細胞生物基因表達轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控的一種普遍方式。隨著miRNAs數(shù)量的不斷增加和功能的深入闡明，miRNA所介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控

2、己被公認為真核生物基因表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重要組成成分之一，并可與轉(zhuǎn)錄因子、表觀遺傳調(diào)控因子等協(xié)同作用，共同完成復(fù)雜生命活動的調(diào)節(jié)。其中，miRNA對紅系分化的調(diào)控受到越來越多的矚目。MiR-144就是其中之一。但miR-144在人造血紅系分化過程中的作用和機制還尚不完全清楚。本研究旨在通過檢測miR-144在K562紅系分化中的調(diào)節(jié)作用，進一步闡明miR-144調(diào)控人紅系分化的機制；構(gòu)建了miR-144真核表達載體，為大量尋找miR-144

3、更多靶基因，為篩選穩(wěn)定表達miR-144的K562細胞株、構(gòu)建miR-144慢病毒奠定基礎(chǔ)。
　　 本研究采用氯化高鐵血紅素(hemin)誘導(dǎo)人慢性髓系白血病細胞系K562可實現(xiàn)在體外模擬紅系分化過程，使用real-time PCR檢測mir-144表達；利用體外合成的寡核苷酸(mimic-144)轉(zhuǎn)染K562細胞，檢測過量表達miR-144對紅系分化的影響；通過軟件預(yù)測鑒別若干個miR-144的候選靶基因，把這些候選基因3'U

4、TR區(qū)包含miRNA結(jié)合位點的序列克隆入pMIR-REPORTTM螢火蟲熒光素酶報告基因終止密碼子下游，與miR-144成熟體共轉(zhuǎn)染293T細胞后檢測報告基因的表達情況。用Western blot在K562細胞中驗證miR-144調(diào)控紅系分化的靶基因。并檢測K562細胞紅系分化過程中靶基因的表達；以正常人基因組DNA為模板擴增包含miR-144前體在內(nèi)的序列，將人miR-144(has-miR-144)基因克隆到真核表達載體pmR-mC

5、herry，構(gòu)建了miR-144真核表達載體。再將pmR-mCherry-miR-144瞬轉(zhuǎn)293T、K562細胞real-time PCR檢測其表達情況。研究取得了以下主要結(jié)果：
　　 1.Hemin誘導(dǎo)K562細胞向紅系分化，γ-globin表達升高，說明誘導(dǎo)成功。miR-144的表達呈明顯上升趨勢(P＜0.05)，提示miR-144對紅系分化發(fā)揮著重要作用。在K562細胞中過表達miR-144后，發(fā)現(xiàn)血紅蛋白合成增加(γ-

6、globin表達升高)及紅系特異的表面分子CD235a的表達都明顯上升，說明過表達miR-144可促進紅系分化。
　　 2.發(fā)現(xiàn)包含有RB3'UTR的報告基因的表達可以被miR-144明顯抑制，把結(jié)合位點順序突變后，這種抑制作用隨之消失。在K562細胞中過表達miR-144后，Western雜交顯示pRB、tRB的水平都明顯降低。這些結(jié)果確定RB是miRNA-144直接的靶基因。
　　 3.發(fā)現(xiàn)在hemin誘導(dǎo)K562向

7、紅系分化過程中，pRB、tRB的表達呈先略上升后明顯下降的趨勢，pRB/GAPDH灰度值最低為：12h0.092±0.007(P＜0.05以0h參照)。說明miR-144可能通過抑制RB而使紅系分化后期細胞周期調(diào)控的減弱，進而產(chǎn)生成熟紅細胞。
　　 4.構(gòu)建了mir-144的真核表達載體pmR-mCherry-miR-144，經(jīng)酶切鑒定正確，測序結(jié)果與GenBank上公布的一致。通過real-time PCR檢測miR-144在