MicroRNA-143真核表達(dá)載體的構(gòu)建及對(duì)靶基因DNMT3A表達(dá)水平的影響.pdf

1、目的:檢測(cè)惡性血液病細(xì)胞株和白血病患者中miR-143的表達(dá)水平及探討其臨床意義,篩選出miR-143低表達(dá)的惡性血液病細(xì)胞株,并將其作為研究miR-143與靶基因DNMT3A關(guān)系的實(shí)驗(yàn)對(duì)象；構(gòu)建miR-143慢病毒表達(dá)載體,研究其在K562細(xì)胞株中對(duì)靶基因DNMT3A表達(dá)的作用及對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡的影響。
　　 方法:應(yīng)用real-time PCR檢測(cè)10種惡性血液病細(xì)胞株和臨床標(biāo)本中miR-143的表達(dá)狀態(tài)及分析其臨床意義；利

2、用分子克隆技術(shù)構(gòu)建miR-143前體慢病毒載體,與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,包裝出高滴度的病毒顆粒,將病毒顆粒感染K562細(xì)胞,獲得穩(wěn)定表達(dá)miR-143的細(xì)胞模型,傳代培養(yǎng)；采用CCK-8法、克隆形成試驗(yàn)觀察過(guò)表達(dá)miR-143后對(duì)K562細(xì)胞的增殖情況；AO/EB染色、Hoechst33258熒光染色法觀察細(xì)胞凋亡情況,Annexin V FITC/PI流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率；real-time PCR檢測(cè)miR-143、DNMT3

3、A、DNMT3B、DNMT1的表達(dá)情況；Western-blotting鑒定過(guò)表達(dá)miR-143后procaspase-3、procaspase-9、DNMT3A、DNMT3B、DNMT1蛋白的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果:(1)白血病患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中miR-143表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)；但miR-143的低表達(dá)與白血病患者的年齡、性別、疾病分型、幼稚細(xì)胞比例,以及融合基因和染色體異常等因素?zé)o明顯相關(guān)性(P>0.05)；化療

4、緩解后骨髓細(xì)胞中miR-143的表達(dá)水平比初治時(shí)明顯上調(diào)(P<0.05)；臨床標(biāo)本中miR-143的表達(dá)與靶基因DNMT3A成顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.665,P<0.05)。(2)成功構(gòu)建了miR-143前體慢病毒載體,real-time PCR及Western-blotting檢測(cè)證實(shí)穩(wěn)定表達(dá)miR-143細(xì)胞株的成功建立。(3)CCK-8方法、克隆形成試驗(yàn)及流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)miR-143能抑制K562細(xì)胞增殖及細(xì)胞G1—

5、S轉(zhuǎn)換。(4)AO/EB及Hoechst33258熒光染色可見(jiàn)細(xì)胞凋亡增加,細(xì)胞核致密濃染；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率增加；miR-143還有可能促進(jìn)procaspase-3、procaspase-9的活化,從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
　　 結(jié)論:(1)miR-143具有抑癌基因的功能在白血病中低表達(dá)。(2)本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了pMAGic7.1-pre miR-143-GFP、Puro慢病毒表達(dá)載體,通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明其可在白血病細(xì)胞中有效表達(dá)并轉(zhuǎn)變