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文檔簡介
1、南昌大學碩士學位論文IKKαβshRNA真核表達載體的構建及穩(wěn)定低表達IKKβHUEVCs系的建立姓名：劉麗麗申請學位級別：碩士專業(yè)：藥理學指導教師：黃起壬201106ABSTRACTABSTRACTObjectiveThisstudyistoconstructashorthairpinRNA(shRNA)eukaryoticexpressionvectortargetingtheIKKa／[3genesbyRNAinterferenc
2、e(RNAi)andtoestablishstableHumanUmbilicalVeinEndothelialCellsline(HUVECs)expressingird(pgeneMethods：TllenucleofidesequencesofIKKa／pgeneswereretrievedfromGenbankAccordingtotheguidelinesforshRNAdesignfourpairsofDNAsequence
3、containingasmallhairpinstructuretargetingtheIICKdDgenesweredesignedandsynthesizedThesynthesizedsequenceswereclonedintopGPU6／GFP／NeoandidentifiedbyrestrictionenzymeanalysisandsequencinganalysisAfterthat，therecombinantvect
4、orsweretransfectedintoHUVECswithlipofectamine2000，andthemosteffectivevectorswerescreenedbyassayingtheIrxa／pproteinlevelsFinallypGPU6／GFP／NeoIKXpshRNA2WastransfectedintoHUVECs，thenG418(600Itg／m1)wasaddedintothemediachange
5、devery35daysWesternblotWasusedtoidentifytheantiG418cellclonesResults：nlerestrictionenzymeanalysisandsequencingshowedthattheeightrecombinantvectorswereconstructedexactlytermed嬲pGPU6／GFP／NeoIKKashRNAl，2，34andpGPU6／GFP／Neoi
6、gaq3一shRNAl，2，3，4WesternblotresultsshowedthattheexpressionlevelsoflKKaandIKKl3proteinswereupregulated，showingsignificantdifferencebetweenHGgroupandControlgroup(P0O1)；theeukaryoticexpressionvectorscontainingthepGPU6／GFP／N
7、eoIKKashRNA4andpGPU6／GFP／NeoirdcpshRNA2efficientlydownregulatedtheproteinexpressionlevelsoflKKaandIKKpgenesinducedbyelevatedglucoseconcentrationinHUVECs(P001)AntiG418cellclonestransfected、析tllpGPU6／GFP／Neo—irdcps㈣A2weref
8、ormedviaG418resistanceWesternblotresultsshowedthattheIKKpproteinexpressionofstableHUVECsexpressingimcpgenewassignificantlyinhibitedConclusion：TherecombinantvectorsareconstructedsuccessfullyandCaninhibitexpressionlevelsof
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