家蠶30K蛋白的鑒定和功能研究.pdf

1、家蠶是鱗翅目的模式昆蟲，具有開放式的血液循環(huán)系統(tǒng)。血液在家蠶的生命活動中承擔(dān)著重要的生理功能，它是體內(nèi)各種營養(yǎng)物質(zhì)和激素等的交換場所。家蠶的血液重量占整個體重的21％～25％，而血液蛋白質(zhì)是血液的主要成分。家蠶30K蛋白是末齡幼蟲和蛹期血液中含量最大的一群蛋白質(zhì)，也是胚胎中主要的卵黃蛋白。30K蛋白屬于鱗翅目昆蟲低分子量脂蛋白家族。到目前為止，已在家蠶、煙草天蛾和粟夜蛾三個物種中鑒定到了該家族的同源蛋白。
　　 家蠶9倍基因組的

2、組裝成功，以及各種鱗翅目昆蟲EST數(shù)據(jù)的公布，為系統(tǒng)性鑒定鱗翅目昆蟲低分子量脂蛋白家族的成員奠定了良好的基礎(chǔ)。本研究在此基礎(chǔ)上，對鱗翅目昆蟲的低分子量脂蛋白進(jìn)行了鑒定，并對它們進(jìn)行了結(jié)構(gòu)分析和進(jìn)化分析。此外，利用已公布的家蠶基因組和芯片數(shù)據(jù)，我們還對家蠶的低分子量脂蛋白基因進(jìn)行了染色體定位分析、組織表達(dá)譜分析和發(fā)育時(shí)期表達(dá)譜分析。
　　 在獲得了以上數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，本研究重點(diǎn)對家蠶低分子量脂蛋白家族中的典型30K蛋白亞家族進(jìn)行了功

3、能研究。利用已經(jīng)制備獲得的BmLP1和BmLP7的抗體，我們對30K蛋白基因的合成、分泌、轉(zhuǎn)運(yùn)和利用等進(jìn)行了系統(tǒng)性的研究。另外，本研究還從家蠶血液中純化獲得了幾種30K蛋白，利用氯仿和甲醇法提取了30K蛋白所結(jié)合的脂類，并進(jìn)一步利用LC-MS/MS對30K蛋白所結(jié)合的脂類進(jìn)行了質(zhì)譜鑒定。
　　 本研究獲得的主要結(jié)果如下:
　　 1.鱗翅目昆蟲低分子量脂蛋白基因的鑒定
　　 (1)鱗翅目昆蟲低分子量脂蛋白基因的鑒定

4、:在家蠶基因組精細(xì)圖序列數(shù)據(jù)和各種鱗翅目昆蟲EST數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，本研究對鱗翅目昆蟲的低分子量脂蛋白家族進(jìn)行了鑒定。在蠶蛾總科、夜蛾總科和螟蛾總科的12個物種中，共鑒定到73個低分子量脂蛋白基因，它們的分布情況如下:家蠶46個、蓖麻蠶5個、琥珀蠶6個、印度柞蠶4個、煙草天蛾3個、草地貪夜蛾1個、粟夜蛾1個、西方豆類夜蛾1個、棉鈴蟲1個、甘藍(lán)夜蛾1個、粉紋夜蛾1個和豆莢野螟蛾1個。在鑒定獲得的73個基因中，有56個基因?yàn)槭状舞b定。
　

5、　 (2)低分子量脂蛋白的結(jié)構(gòu)分類:對鑒定到的基因進(jìn)行序列比對，發(fā)現(xiàn)它們根據(jù)結(jié)構(gòu)可以分為三個亞家族:典型30K蛋白（Typical30KP）、富含絲氨酸和蘇氨酸的30K蛋白(S/T-rich30KP)和ENF肽結(jié)合蛋白(ENF-BP)。這三個亞家族有著相似的C端序列，都由一個NTD和一個CTD組成，而它們的N端序列差別很大。典型30K蛋白的N端由信號肽和一段很短的不保守區(qū)域組成;S/T-rich30KP的N端則由信號肽和一個富含絲氨酸

6、和蘇氨酸的結(jié)構(gòu)域(STD)組成;ENF肽結(jié)合蛋白的N端由一個惡臭假單胞菌同源區(qū)(PPD)組成。
　　 (3)低分子量脂蛋白的進(jìn)化分析:在蠶蛾總科中，同時(shí)存在典型30K蛋白、富含絲氨酸和蘇氨酸的30K蛋白和ENF肽結(jié)合蛋白亞家族。但在夜蛾總科和螟蛾總科中，我們只鑒定到了ENF肽結(jié)合蛋白亞家族。并且，在全基因組已被測序的棉鈴蟲中，也只能鑒定到ENF肽結(jié)合蛋白亞家族。這些結(jié)果表明，ENF肽結(jié)合蛋白亞家族是三個亞家族中起源最早的一個亞家

7、族。富含絲氨酸和蘇氨酸的30K蛋白只在家蠶中鑒定到，可能為家蠶特有的一群低分子量脂蛋白。
　　 2.家蠶低分子量脂蛋白基因的特征分析
　　 (1)家蠶低分子量脂蛋白基因的染色體定位:家蠶中共鑒定到46個低分子量脂蛋白基因，其中的43個基因能定位到染色體上。Bmlp1～Bmlp32（24個典型30K蛋白基因和8個富含絲氨酸和蘇氨酸的30K蛋白基因）全部定位于第20號染色體的nscaf2795重疊群上的970Kbp(1380

8、K～2350K)區(qū)域內(nèi)，它們在染色體上呈串聯(lián)重復(fù)分布。家蠶的10個ENF肽結(jié)合蛋白基因中，有8個基因構(gòu)成了4個基因?qū)?Bmlp37/38、Bmlp40/39、Bmlp41/42和Bmlp44/45)，定位于第7號、22號和24號染色體上，每個基因?qū)?nèi)的2個基因的轉(zhuǎn)錄方向相反。
　　 (2)家蠶低分子量脂蛋白基因的表達(dá)特征分析:家蠶中的三群低分子量脂蛋白基因的組織和時(shí)期表達(dá)特征各不相同，暗示它們存在功能的分化。典型30K蛋白基因主

9、要在脂肪體和體壁中表達(dá)，部分30K蛋白基因在一齡到四齡幼蟲期表達(dá)，部分在五齡幼蟲到蛾期表達(dá)。ENF肽結(jié)合蛋白基因主要在血細(xì)胞中表達(dá)，可能參與了血細(xì)胞的免疫調(diào)控過程。富含絲氨酸和蘇氨酸的30K蛋白基因主要在羽化前一天和化蛾第一天有表達(dá)，在精巢中的表達(dá)量很高，而在卵巢中幾乎不表達(dá)。根據(jù)其富含絲氨酸和蘇氨酸的特征，推測可能參與受精或者精子的形成過程。
　　 3.家蠶30K蛋白的合成、分泌、轉(zhuǎn)運(yùn)和利用
　　 (1)家蠶30K蛋白

10、的合成和分泌:通過RT-PCR技術(shù)分析不同發(fā)育時(shí)期脂肪體中30K蛋白基因的合成模式。同時(shí)，通過westemblotting技術(shù)對不同發(fā)育時(shí)期血液中30K蛋白的變化情況進(jìn)行分析。綜合以上兩方面結(jié)果，表明30K蛋白是由脂肪體合成，然后分泌入血液。
　　 (2)家蠶30K蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn):在蛹期和蛾期時(shí)，血液中的30K蛋白逐漸減少，而卵巢中的30K蛋白卻逐漸增加。RT-PCR結(jié)果表明，卵巢中的30K蛋白并非自身合成而來。因此，卵巢中的30K

11、蛋白可能是從血液中轉(zhuǎn)運(yùn)而來。通過制備30K蛋白親和柱，對卵巢膜蛋白進(jìn)行pull-down實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)卵黃原蛋白受體能與30K蛋白結(jié)合，因此推測卵黃原蛋白受體可能是介導(dǎo)30K蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的受體。免疫組織化學(xué)定位結(jié)果表明，30K蛋白主要轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)卵巢的卵母細(xì)胞內(nèi)儲存起來。
　　 (3)家蠶30K蛋白的利用:對不同發(fā)育時(shí)期的胚胎蛋白質(zhì)進(jìn)行westernblotting分析，發(fā)現(xiàn)30K蛋白主要在胚胎的最后兩天減少。對不同發(fā)育時(shí)期的胚胎進(jìn)行酶活分析

12、，發(fā)現(xiàn)酶活從胚胎第5天后升高，到蟻蠶時(shí)達(dá)到最大值。提取蟻蠶粗提物，并與30K蛋白進(jìn)行體外孵育，發(fā)現(xiàn)蟻蠶粗提物能夠降解30K蛋白。對第6天和第10天的胚胎進(jìn)行免疫組織化學(xué)定位，結(jié)果表明30K蛋白在胚胎早期主要定位于胚外的卵黃顆粒中，在胚胎后期定位于胚子的腸腔內(nèi)。綜合以上結(jié)果，發(fā)現(xiàn)30K蛋白在反轉(zhuǎn)期前定位于胚外卵黃顆粒中，反轉(zhuǎn)期后由胚子吞入腸腔內(nèi)，再由腸腔內(nèi)的蛋白酶對30K蛋白進(jìn)行降解，為蟻蠶的孵化提供能量來源。
　　 4.家蠶30

13、K蛋白的純化及其結(jié)合脂類的鑒定
　　 (1)30K蛋白的純化:通過硫酸銨沉淀、疏水作用層析和陽離子交換層析成功地從家蠶五齡第7天血液中純化到BmLP1、BmLP7、含2種30K蛋白的組分和含4種30K蛋白的組分。
　　 (2)30K蛋白載脂功能的驗(yàn)證:對純化的30K蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，并用油紅O染色法染色，結(jié)果表明純化得到的30K蛋白含有脂類，表明30K蛋白具有載脂功能。
　　 (3)30K蛋白所結(jié)合脂

14、類的鑒定:采用氯仿和甲醇法提取30K蛋白所結(jié)合的脂類，并用LC-MS/MS進(jìn)行鑒定。共鑒定到12種含量較高的脂類，其中分子式為C22H35O6、C25H31O8和C12H13O4的脂類較多，尤以分子式為C25H31O8的脂類最多，且該脂類含有多個同分異構(gòu)體。但是，由于這些脂類分子結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，質(zhì)譜碎裂時(shí)無法得到它們的結(jié)構(gòu)信息，因而目前無法推測它們的結(jié)構(gòu)式，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)對其結(jié)構(gòu)式進(jìn)行鑒定。
　　 (4)胚胎中脂類的利用:利用薄層層

15、析方法對不同發(fā)育時(shí)期胚胎中的脂類進(jìn)行分離，結(jié)果顯示脂類主要在胚胎后期被消化吸收，而30K蛋白也是在胚胎后期被利用。因此，我們認(rèn)為在胚胎利用30K蛋白的同時(shí)，30K蛋白所結(jié)合的脂類也一起被胚胎利用。
　　 綜合第3和第4點(diǎn)的結(jié)果，我們對家蠶30K蛋白的功能有了進(jìn)一步的認(rèn)識。從五齡期到上蔟期，幾個30K蛋白基因（Bmlp1～Bmlp4，Bmlp7）在家蠶脂肪體中高量表達(dá)，之后分泌入家蠶血液中。在五齡末期的血液中30K蛋白含量最大，之