家蠶腸道免疫相關(guān)分子的鑒定及功能研究.pdf

1、昆蟲擁有一個(gè)在進(jìn)化上保守的先天免疫系統(tǒng)來識(shí)別和消滅入侵的病原微生物。而腸道屏障是昆蟲先天免疫的第一道防線，為了抵御病原微生物的感染，昆蟲腸道形成了一套完整的免疫應(yīng)答體系。盡管在昆蟲腸道中通過基因組、蛋白質(zhì)組的同源序列比對(duì)或者直接與病原微生物結(jié)合的方法鑒定到了多個(gè)免疫相關(guān)分子，但是對(duì)于昆蟲腸道免疫應(yīng)答的機(jī)制以及未知的腸道免疫分子的了解還是有限的。因此，本文的目的就是通過新的方法來鑒定家蠶（Bombyx mori）腸道中未知的免疫相關(guān)分子并

2、且進(jìn)一步研究它們參與免疫應(yīng)答的分子機(jī)制。
　　本研究為了進(jìn)一步鑒定新的家蠶腸道免疫相關(guān)分子，構(gòu)建了家蠶中腸T7噬菌體 cDNA展示文庫，并且利用不同的生物學(xué)配體如幾丁質(zhì)（Chitin）、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、黑胸?cái)⊙堪麠U菌（Bacillus bombyseptieus, Bb）以及沙雷氏菌（Serratia marcescens, Sm）等對(duì)所構(gòu)建的噬菌體展示文庫進(jìn)行生物學(xué)淘選。并進(jìn)一步對(duì)所淘選

3、到的分子進(jìn)行生物學(xué)驗(yàn)證以及對(duì)其參與腸道免疫應(yīng)答的機(jī)制進(jìn)行揭示。獲得的主要結(jié)果如下：
　　1.構(gòu)建家蠶中腸cDNA T7噬菌體展示文庫以及配體結(jié)合多肽的淘選
　　構(gòu)建了家蠶中腸cDNA T7噬菌體展示文庫，插入片段大小在300 bp-2000 bp之間，文庫原始滴度為1×105 pfu/mL，擴(kuò)增后的滴度為8×1010 pfu/mL，文庫重組率為96％，重組子中大約有57%的插入片段大于250 bp。用幾丁質(zhì)、脂多糖、黑胸?cái)⊙?/p>

4、芽胞桿菌和沙雷氏菌為配體淘選噬菌體展示文庫，獲得了多個(gè)免疫相關(guān)候選蛋白，如翻譯控制的腫瘤蛋白、幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白、氨肽酶N、真菌蛋白酶抑制劑F以及β葡聚糖識(shí)別蛋白等。其中在用上述四種不同配體淘選的時(shí)候都能獲得翻譯控制的腫瘤蛋白，說明該蛋白可能參與對(duì)上述幾種配體的識(shí)別。
　　2.細(xì)胞水平上鑒定家蠶TCTP的免疫功能
　　免疫組化和Western blotting結(jié)果顯示，TCTP由腸道細(xì)胞合成并分泌到腸腔中，但不能穿透圍食膜進(jìn)入腸

5、液。另外，血淋巴中也檢測(cè)到少量TCTP的存在。微生物感染家蠶，腸道可溶性TCTP呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。血細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TCTP能與微生物結(jié)合，促進(jìn)血細(xì)胞對(duì)微生物的吞噬，起著調(diào)理素的作用。另外，TCTP可以誘導(dǎo)家蠶BmNs細(xì)胞產(chǎn)生抗菌肽，用ERK抑制劑U0126和PD098059能抑制TCTP誘導(dǎo)家蠶細(xì)胞產(chǎn)生抗菌肽，且具有劑量依賴效應(yīng)。家蠶細(xì)胞瞬時(shí)干涉ERK后，TCTP不能誘導(dǎo)其產(chǎn)生抗菌肽。ERK磷酸化抗體免疫印跡結(jié)果顯示，TC

6、TP能誘導(dǎo)家蠶細(xì)胞ERK發(fā)生動(dòng)態(tài)磷酸化的變化，且在5 min磷酸化水平最高，持續(xù)到10 min，之后逐漸降低，30 min降到起始水平。
　　3.個(gè)體水平上驗(yàn)證家蠶TCTP的免疫功能
　　成功構(gòu)建了家蠶中腸TCTP轉(zhuǎn)基因干涉載體，獲得了穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因干涉品系。通過qRT-PCR和Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與正常大造相比，轉(zhuǎn)基因干涉家蠶的中腸TCTP無論在轉(zhuǎn)錄水平還是翻譯水平都得到了有效干涉。對(duì)轉(zhuǎn)基因家蠶添食致

7、病微生物后，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因干涉中腸TCTP的家蠶抗菌肽不能被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，且家蠶存活率降低。用磷酸化的ERK抗體免疫印跡結(jié)果顯示，正常大造感染微生物后ERK會(huì)發(fā)生磷酸化的動(dòng)態(tài)變化，而轉(zhuǎn)基因干涉中腸TCTP的家蠶添食微生物后，ERK的磷酸化水平比較低，且在感染的前12 hr呈現(xiàn)一直下降的趨勢(shì)，12 hr后有升高的趨勢(shì)。綜上所述，轉(zhuǎn)基因干涉家蠶中腸TCTP感染微生物后，擾亂了ERK磷酸化的動(dòng)態(tài)變化，導(dǎo)致抗菌肽的產(chǎn)生下降，并進(jìn)一步降低了家蠶的存活