家蠶3-dehydroecdysone 3β-reductase基因表達(dá)和功能鑒定.pdf

1、昆蟲(chóng)蛻皮激素(Ecdysone)滴度的周期性變化決定了昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)和發(fā)育[1]。蛻皮激素的生理平衡由其自身的合成與降解控制的。近年來(lái)，蛻皮激素合成途徑的研究已日益清晰，然而關(guān)于其降解代謝途徑還研究不多。蛻皮激素代謝主要有兩種：直接隨昆蟲(chóng)的排泄物排出體外；經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的轉(zhuǎn)化形成非活性的形式[2]。
　　 Koolman(1989)的研究發(fā)現(xiàn)在很多昆蟲(chóng)體內(nèi)，尤其是鱗翅目昆蟲(chóng)，蛻皮激素主要以3-脫氫蛻皮激素(3-dehydroecdyso

2、ne，3DE)的形式存在。3DE只有很微弱的蛻皮激素活性，因此被認(rèn)為是昆蟲(chóng)蛻皮激素代謝的一種主要方式[3]。蛻皮激素在蛻皮激素氧化酶(ecdysone oxidase)的作用下轉(zhuǎn)化成3DE，緊接著3DE在依賴NAD(P)H的3-脫氫蛻皮激素-3α還原酶(3-dehydroecdysone-3α-reductase)的不可逆的催化作用下生成3-異構(gòu)蛻皮激素(3-epiecdysteroid)[4]。
　　 另一方面，血淋巴中的3D

3、E在依賴NAD(P)H的3-脫氫蛻皮激素-3β還原酶(3-dehydroecdysone-3β-reductase)的催化下生成蛻皮激素。前胸腺是昆蟲(chóng)分泌蛻皮激素及3DE的主要器官，之前研究發(fā)現(xiàn)3DE與蛻皮激素的比例在不同物種中有很大的差異，而3-脫氫蛻皮激素-3β還原酶作為3DE與蛻皮激素相互轉(zhuǎn)化的酶之一，它對(duì)昆蟲(chóng)蛻皮激素滴度的變化可能也起著重要的作用[5]。
　　 隨著該途徑的發(fā)現(xiàn)，3-脫氫蛻皮激素-3β還原酶也從?；页嵋苟?/p>

4、(Spodopteralittoralis)以及粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)中純化出來(lái)[5，6]。早在1996年，家蠶的3-dehydroecdysone-3β-reductase就從幼蟲(chóng)的血淋巴中經(jīng)過(guò)六步的純化得到的，并且在體外分析得到了該酶的酶促動(dòng)力學(xué)參數(shù)[7]。然而，至今該基因仍未被鑒定出。
　　 家蠶在作為一種鱗翅目模式昆蟲(chóng)，開(kāi)始逐步成為基因功能研究的理想材料。隨著家蠶基因組和基因芯片數(shù)據(jù)的公布，也為研究家

5、蠶基因提供了極好的信息平臺(tái)。本研究在家蠶基因組數(shù)據(jù)庫(kù)的基礎(chǔ)上，對(duì)影響家蠶蛻皮激素形成途徑中的基因家蠶3-dehydroecdysone-3β-reductase基因進(jìn)行了深入系統(tǒng)的研究。主要研究結(jié)果如下：
　　 1、基因的生物信息學(xué)分析基于NCBI和家蠶基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)家蠶Bm3DE-3β-reductase基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，該基因全長(zhǎng)1032 bp，包括8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子，編碼343個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白的分子量為39

6、 kDa，等電點(diǎn)(PI)為5.69，位于家蠶第2號(hào)染色體的nscaf2053上。經(jīng)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，家蠶(Bm3DE-3β-reductase)與粉紋夜蛾(Tn-3DE-3β-reductase)，海灰翅夜蛾(S1-3DE-3β-reductase)等物種均含有aldo-keto結(jié)構(gòu)域。進(jìn)化分析表明，Bm3DE-3β-reductase基因與鱗翅目中其他昆蟲(chóng)3DE-3β-reductase基因的進(jìn)化關(guān)系較近。
　　 2、家蠶

7、Bm3DE-3β-reductase基因的表達(dá)特征分析RT-PCR表達(dá)分析可知，Bm3DE-3β-reductase基因從5齡1天時(shí)表達(dá)量很低，而到達(dá)幼蟲(chóng)5齡7天和上蔟開(kāi)始時(shí)表達(dá)最大，上蔟24h之后幾乎不表達(dá)。Bm3DE-3β-reductase在5齡的表達(dá)模式與家蠶的蛻皮時(shí)間比較一致，在組織層面上，Bm3DE-3β-reductase基因在頭部，表皮，脂肪體，卵巢表達(dá)很高，在血淋巴中表達(dá)次之。
　　 3、家蠶Bm3DE-3β-

8、reductase基因的原核表達(dá)與多克隆抗體制備將Bm3DE-3β-reductase基因中編碼第22至343個(gè)氨基酸殘基的成熟肽基因片段亞克隆到PGEX-4T-1原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化BL21(DE3)誘導(dǎo)表達(dá)，并經(jīng)GST親和層析純化靶蛋白，以此為抗原用小鼠制備了抗家蠶Bm3DE-3β-reductase的多克隆抗體。Western blotting檢測(cè)原核表達(dá)的靶蛋白，表明融合蛋白具有家蠶Bm3DE-3β-reductase的抗原性，抗

9、體免疫特異性較高。
　　 4、家蠶Bm3DE-3β-reductase的組織定位利用western blotting檢測(cè)Bm3DE-3β-reductase基因在蛋白質(zhì)水平的組織分布情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在家蠶脂肪體和血細(xì)胞中有很高的表達(dá)。進(jìn)一步，我們通過(guò)免疫組化的方法，在這兩個(gè)組織中探測(cè)到了很強(qiáng)的信號(hào)，證實(shí)了其表達(dá)情況。
　　 4.家蠶Bm3DE-3β-reductase基因的真核表達(dá)及功能鑒定將Bm3DE-3β-reduct