家蠶BmPLA2和BmRab3基因的分子克隆、表達(dá)和功能研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開(kāi)論述：
　　Part-Ⅰ 含WD40保守域并導(dǎo)致脂肪體消融的家蠶BmPLA2的分子克隆、表達(dá)和體內(nèi)干擾
　　PLA2是參與水解花生四烯酸以及其他多種不飽和脂肪酸的超級(jí)酶家族中的一員，這些酶從sn-2位置釋放出自由的花生四烯酸和一個(gè)溶血磷脂。目前對(duì)PLA2在脊椎動(dòng)物上的研究主要是借助于細(xì)菌感染的炎癥免疫應(yīng)答反應(yīng)。PLA2酶包含最大的磷脂酶類(lèi)，參與體內(nèi)脂質(zhì)信號(hào)分子如花生四烯酸的體內(nèi)釋放。已有關(guān)于PLA2

2、在免疫相關(guān)組織如血細(xì)胞和脂肪體上的活性研究。在本文中，我們克隆了家蠶脂肪體的PLA2相關(guān)基因，命名為BmPLA2。該基因全長(zhǎng)1.031kb，編碼37.64 kDa的蛋白質(zhì)。生物信息學(xué)分析此蛋白質(zhì)含有一個(gè)假想的WD40保守結(jié)構(gòu)域，與Danaus plexippus同源。在我們所研究的家蠶組織中，BmPLA2在五齡第3天家蠶的脂肪體高表達(dá)，皮膚組織中低表達(dá)。我們還研究了BmPLA2在較早齡期幼蟲(chóng)中的差異表達(dá)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)該基因雌蛹表達(dá)量高于雄蛹

3、。RNAi介導(dǎo)的基因沉默結(jié)果顯示干擾24h、48h、72h后BmPLA2表達(dá)量明顯降低，同時(shí)觀察到干擾后的幼蟲(chóng)和蛹表現(xiàn)出成蟲(chóng)致死和不發(fā)育。另外，我們還觀察了經(jīng)RNAi誘導(dǎo)后的幼蟲(chóng)脂肪體細(xì)胞的形態(tài)特征，為BmPLA2基因及其功能的進(jìn)一步研究作了探討。
　　Part-Ⅱ C端具有GGT2結(jié)合位點(diǎn)的BmRab3在家蠶中部絲腺的高度表達(dá)
　　酵母Ypt1和含有哺乳動(dòng)物Rab（Ras相關(guān)蛋白發(fā)現(xiàn)與腦部）GTPase的Sec4蛋白被發(fā)現(xiàn)

4、已有二十年，它們?cè)谶M(jìn)化上高度保守，并且是重要的膜運(yùn)輸調(diào)節(jié)因子。RabGTPase是被稱(chēng)為Ras GTPases超級(jí)家族的成員。目前，Ras家族中已有超過(guò)70個(gè)的Rab及Rab類(lèi)似物被報(bào)道。很明顯地，Rab GTPases作為一種分子開(kāi)關(guān)，以活性和非活性?xún)煞N狀態(tài)循環(huán)，實(shí)際上起到了整合雙層膜運(yùn)輸結(jié)構(gòu)和細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)的作用。雖然它們分子結(jié)構(gòu)較小，但Rab GTPases具有多個(gè)互作位點(diǎn)，而且它們?cè)诠δ芎徒Y(jié)構(gòu)上的交互作用機(jī)制是非常重要的。此家族

5、其中一個(gè)成員Rab3 GTPase在囊泡運(yùn)輸過(guò)程中起重要作用，除了在脂肪細(xì)胞、周緣組織和外分泌腺中的活性之外，其高表達(dá)于腦部及內(nèi)分泌腺。有趣的是，像家蠶等鱗翅目昆蟲(chóng)絲腺在轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)及其他研究中成為重要的研究材料。在絲蛋白的諸多機(jī)制尚不明確的情況下，本文通過(guò)熒光定量PCR方法，首次報(bào)道了BmRab3基因在家蠶中部絲腺的高表達(dá)。生物信息學(xué)分析，此基因的理論等電點(diǎn)5.52，蛋白分子量24.3 kDa.BmRab3含有C端GGT2結(jié)合位點(diǎn)，并包含

6、兩個(gè)推定的GEF/GDI作用位點(diǎn)。多重序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)其與其他物種Rab3的高度相似性。進(jìn)化樹(shù)分析BmRab3位于T.castanium和A.aegypti之間。除其他的家蠶組織以外，我們還分別測(cè)得了該基因在中部絲腺，后部絲腺以及整個(gè)的絲腺中表達(dá)了BmRab3基因。結(jié)果顯示，BmRab3在中部絲腺的表達(dá)高于后部絲腺和整個(gè)絲腺組織。此外，BmRab3在早期家蠶幼蟲(chóng)的表達(dá)趨勢(shì)不同，并且在雄蛹的表達(dá)量高于雌蛹?；铙wBmRab3 dsRNA干擾顯示