家蠶atonal基因的分子克隆和特性研究.pdf

1、家蠶（Bombyxmori）是重要的鱗翅目模式昆蟲，家蠶基因組測序工作在2003年10月即已完成，并于2008年8月完成家蠶bHLH家族成員的鑒定。家蠶有52個bHLH基因，系統(tǒng)進(jìn)化樹分析把它們分成39個家族，六個組。然而，有關(guān)家蠶bHLH基因及其功能的研究報道較少。迄今為止，只有ASCa家族的4個成員和Twist家族、AP4家族、Bmal家族、Trh家族各有1個成員的基因得到克隆，并檢測了它們在家蠶不同組織中的表達(dá)情況。
　　

2、 atonal基因?qū)儆赽HLH轉(zhuǎn)錄因子的Atonal家族，最早于1993年在果蠅中被發(fā)現(xiàn)，隨后在赤擬谷盜，河豚魚，雞，小鼠以及人中相繼發(fā)現(xiàn)了該基因，然而關(guān)于家蠶atonal基因的研究仍報道較少。
　　 本文利用生物信息學(xué)和實驗方法得到了家蠶bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因atonal，并對其進(jìn)行了分析和鑒定，為進(jìn)一步研究atonal的功能積累了一些基礎(chǔ)信息資料。實驗研究的主要結(jié)果如下:
　　 1.生物信息學(xué)分析表明，家蠶atonal

3、基因全長644bp，包括60bp的5'-UTR，170bp的3'-UTR，414bp的開放閱讀框(ORF)，編碼138個氨基酸，預(yù)計相對分子質(zhì)量為15.5kDa。從獲得的基因結(jié)構(gòu)來看，該基因在編碼區(qū)內(nèi)沒有內(nèi)含子，有轉(zhuǎn)錄起始位點和poly(A)加尾信號，編碼區(qū)內(nèi)存在一個保守的功能結(jié)構(gòu)域bHLH基序，位于cDNA的No.301-No.459。多序列比對分析發(fā)現(xiàn)，Bmatonal的氨基酸序列和其他物種在bHLH基序區(qū)有較高保守性。系統(tǒng)發(fā)生分析

4、結(jié)果表明，家蠶atonal序列與大紅斑蝶的atonal序列形成單進(jìn)化枝。
　　 2.根據(jù)cDNA序列設(shè)計引物擴(kuò)增出家蠶atonal編碼序列，利用pGEX-4T-2表達(dá)系統(tǒng)在大腸桿菌BL21中進(jìn)行了表達(dá)，得到了分子量約41.5kDa的融合蛋白，westernblotting鑒定正確。通過割膠對目的蛋白純化回收后免疫新西蘭大白兔，制備抗家蠶Atonal蛋白的血清。
　　 3.對家蠶不同發(fā)育階段和組織進(jìn)行RT-PCR分析，結(jié)果

5、表明atonal在家蠶各個發(fā)育階段和幼蟲不同組織都有表達(dá)，其中神經(jīng)節(jié)及五齡幼蟲的表達(dá)量相對較高。提取五齡幼蟲各組織蛋白進(jìn)行westernblotting分析，其結(jié)果與RT-PCR的分析結(jié)果一致即atonal在各組織均有表達(dá)。細(xì)胞免疫熒光顯示家蠶Atonal蛋白主要定位在細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞核膜中少量表達(dá)。
　　 4.利用家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，在家蠶BmN細(xì)胞系中成功過表達(dá)了重組的Atonal蛋白，westernblotting鑒定條帶