家蠶Roadblock功能域基因和幾丁質(zhì)脫乙酰基酶基因的分子克隆與功能分析.pdf

1、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor)超家族由一類(lèi)結(jié)構(gòu)、功能相關(guān)的多肽生長(zhǎng)因子亞家族組成，其中包括TGF-β、活化素(activin)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、生長(zhǎng)分化因子(GDF)等。TGF-β除了影響細(xì)胞的增殖、分化外，還在胚胎發(fā)育、胞外基質(zhì)形成、骨的形成和重建等方面起著重要作用。TGF-β家族成員廣泛存在于從果蠅到人等多種生物的各種組織中，對(duì)正常細(xì)胞、癌變細(xì)胞都有著顯著作用。隨著對(duì)于TGFβ信號(hào)通

2、路研究的深入，其他的一些能夠介導(dǎo)各種不同的生物學(xué)反應(yīng)的TGFβ信號(hào)通路成員也將陸續(xù)得被發(fā)現(xiàn)。Jin等通過(guò)酵母雙雜交篩選鑒定出新的能夠與TGFβ-R結(jié)合的蛋白，即Robl1和Robl2，它們是負(fù)責(zé)運(yùn)輸?shù)膭?dòng)力蛋白輕鏈。當(dāng)細(xì)胞受到TGFβ信號(hào)分子刺激后，Robl通過(guò)TGFβ-RⅡ磷酸化后激活，激活的Robl與激活的Smad2/3結(jié)合并將它們招募到動(dòng)力蛋白復(fù)合體上，最終將Smad2/3運(yùn)輸?shù)胶藘?nèi)DNA上，Smad2/3再和其他一些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合調(diào)

3、控靶基因的表達(dá)，從而產(chǎn)生各種生物學(xué)效應(yīng)。由于Robl基因的許多新功能還未全部解明，通過(guò)研究家蠶中Robl基因的功能和產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)，是解析Robl基因新功能的有效途徑。
　　 TOR(雷帕霉素靶標(biāo))作為一種重要的調(diào)節(jié)基因，TOR匯聚了來(lái)自細(xì)胞內(nèi)外的營(yíng)養(yǎng)、生長(zhǎng)因子、能量和環(huán)境壓力的信號(hào)，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞能量代謝等多種途徑發(fā)揮重要的生理功能，在細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)、分化過(guò)程中起著中心調(diào)控點(diǎn)的作用。mTOR信號(hào)的失調(diào)會(huì)

4、導(dǎo)致很多疾病中出現(xiàn)，包括癌癥和代謝紊亂等?；岽碳つ軌蛘T導(dǎo)mTORC1的激活，而Ragulator的重要成分P14對(duì)于TOR信號(hào)的激活是必需的。目前的主要研究都是集中在哺乳動(dòng)物的細(xì)胞之中，并且P14具體發(fā)揮功能的機(jī)制仍然不清楚，因此，研究它詳細(xì)的功能具有重要意義。
　　 幾丁質(zhì)脫乙?；?Chitin deacetylases，CDAs)是新近發(fā)現(xiàn)的一種參與調(diào)控分解昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)的重要酶類(lèi)。幾丁質(zhì)經(jīng)CDAs作用形成脫乙酰幾丁質(zhì)(或稱(chēng)

5、聚葡萄糖胺)，脫乙酰幾丁質(zhì)又可進(jìn)一步被CDAs分解成氨基葡萄糖。昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)脫乙?；傅难芯渴墙鼛啄瓴砰_(kāi)展的，對(duì)其作用與調(diào)控機(jī)制知之甚少。為了研究昆蟲(chóng)CDAs作用機(jī)制及調(diào)控機(jī)理，探討CDAs對(duì)昆蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育的影響，我們采用了生長(zhǎng)發(fā)育特征明顯、體內(nèi)組織器官易于區(qū)分的大型模式昆蟲(chóng)-家蠶作為研究材料，對(duì)家蠶CDAs基因結(jié)構(gòu)、mRNA選擇性剪切模式及不同剪切體表達(dá)差異進(jìn)行了研究。
　　 本論文在分析大量家蠶組織EST數(shù)據(jù)、基因組數(shù)據(jù)等的基礎(chǔ)

6、上，利用RT-PCR和RACE技術(shù)克隆了家蠶BmRobl基因、BmP14基因和BmCDAs基因，并對(duì)BmRobl與BmCDAs基因的功能做了研究，具體研究結(jié)果如下：
　　 1、通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索、電子克隆、RT-PCR等方法克隆了家蠶BmRobl、BmP14基因，BmRobl cDNA全長(zhǎng)序列由853 bp堿基組成，5’UTR和3’UTR分別為60bp、469bp，ORF長(zhǎng)294bp，編碼97個(gè)氨基酸；BmP14cDNA全長(zhǎng)序列由1

7、263bp堿基組成，5’UTR和3’UTR為176bp、709bp ORF長(zhǎng)378bp，編碼125個(gè)氨基酸。利用生物信息學(xué)的方法解析氨基酸序列的結(jié)構(gòu)與功能域信息，BmRobl與BmP14氨基酸序列都含有一個(gè)Roadblock功能域。BmRobl與BmP14蛋白的同源性只有9％，但BmRobl與脊椎動(dòng)物的P14蛋白的同源性反而比家蠶自身高，具有12％的同源性。在已知的物種中，Robl蛋白與P14蛋白的氨基酸相同率都在10％左右，同源性較低

8、。Robl和P14都含有一個(gè)相似的Roadblock功能域，但它們的序列相差很大，進(jìn)化樹(shù)分析暗示它們可能屬于Robl超家族的2個(gè)不同亞家族。Robl蛋白R(shí)oadblock功能域由2個(gè)α螺旋和5個(gè)β折疊形成，P14蛋白的Roadblock功能域由3個(gè)α螺旋和5個(gè)β折疊形成；Robl蛋白的2個(gè)alfa螺旋包圍著5個(gè)β折疊形成類(lèi)似三明治的結(jié)構(gòu)，而P14蛋白含有3個(gè)α螺旋，其中一個(gè)α螺旋插入到beta折疊中，余下的2個(gè)α螺旋在它們兩端，這說(shuō)明雖

9、然Robl和P14均是由α螺旋和β折疊形成的Roadblock功能域構(gòu)成，但其結(jié)構(gòu)還是存在差異，暗示著Robl和P14在生物學(xué)功能上的差異。
　　 2、利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了BmRobl蛋白，制備了多抗，經(jīng)western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)特異性良好，為下步實(shí)驗(yàn)做好了準(zhǔn)備。
　　 3、通過(guò)Realtime PCR技術(shù)對(duì)BmRobl基因組織特異性表達(dá)和時(shí)期特異性表達(dá)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)BmRobl在家蠶組織中的差異表達(dá)，此基因在

10、各組織中均有表達(dá)，但在大腦、翅原基已及性腺中的表達(dá)水平較高。因?yàn)镽obl在有絲分裂和減數(shù)分裂過(guò)程發(fā)揮著重要的功能，且對(duì)軸突的運(yùn)輸和成精神細(xì)胞的生成至關(guān)重要；而卵巢和精巢產(chǎn)生配子減數(shù)分裂旺盛，翅原基在胚胎后期需要進(jìn)行有絲分裂，大腦的信號(hào)指令需要軸突的運(yùn)輸；所以BmRobl在大腦、卵巢、精巢和翅原基中高水平表達(dá)。我們還分析了不同發(fā)育時(shí)期BmRobl，基因在翅原基的表達(dá)變化。結(jié)果顯示BmRobl轉(zhuǎn)錄體在預(yù)蛹期的水平最高，在進(jìn)入蛹期后表達(dá)水平下

11、調(diào)。家蠶的預(yù)蛹期和蛹期是變態(tài)期，在此過(guò)程中，一些組織發(fā)生程序性細(xì)胞凋亡，另一些組織如翅原基通過(guò)細(xì)胞分裂激劇生長(zhǎng)。BmRobl基因在家蠶變態(tài)期的表達(dá)變化顯示BmRobl基因可能在變態(tài)期的組織生長(zhǎng)、細(xì)胞分裂過(guò)程中扮演著重要的角色。
　　 4、分析了家蠶細(xì)胞系BmRobl基因在紫外和釩酸鹽刺激條件下，mRNA水平和蛋白質(zhì)水平所發(fā)生的變化。熒光定量PCR和免疫印記實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BmRobl基因隨著紫外刺激的時(shí)間和釩酸鈉培養(yǎng)濃度的增加，無(wú)

12、論是在mRNA水平還是蛋白質(zhì)水平都顯著下調(diào)。紫外和釩酸鹽共處理與只是紫外或釩酸鹽單獨(dú)處理相比，下調(diào)的更加顯著，這暗示著Robl可能是一個(gè)保守的光刺激敏感基因，紫外刺激和釩酸鹽可能協(xié)同地發(fā)揮作用下調(diào)BmRobl基因。
　　 5、利用RACE法克隆了家蠶CDAs的cDNA全長(zhǎng)序列，鑒定出BmCDAs基因mRNA存在2種剪接體，命名為BmCDA1和BmCDA2，外顯子遺漏是BmCDA1和BmCDA2的mRNA的主要剪接模式。利用生物信

13、息學(xué)方法分析表明BmCDA基因組由6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子組成；推測(cè)BmCDA1和BmCDA2的氨基酸序列都包含幾丁質(zhì)脫乙酰基(CDA)結(jié)構(gòu)域、幾丁質(zhì)結(jié)合(ChBD)結(jié)構(gòu)域和低密度脂蛋白受體類(lèi)A(LDLa)結(jié)構(gòu)域等3個(gè)功能域，但二者的ChBD結(jié)構(gòu)域有部分氨基酸殘基不同?；诠δ苡蚧蚝拖到y(tǒng)進(jìn)化法分析，昆蟲(chóng)CDA蛋白可分成5大類(lèi)，BmCDA1和BmCDA2屬于第1大類(lèi)，是具有全部3個(gè)功能域典型的昆蟲(chóng)CDA蛋白。熒光定量PCR分析表明BmCD