家蠶類survivin基因的功能分析.pdf

1、Survivin(svv)基因是抗凋亡(inhibitors of apoptosis proteion，IAP)基因家族中最小的新成員，僅含有一個(gè)桿狀病毒抗凋亡重復(fù)結(jié)構(gòu)域(baculovirus IAP repeat，BIR)和C端有一個(gè)α螺旋的結(jié)構(gòu)域。研究發(fā)現(xiàn)svv在癌組織或腫瘤組織中高表達(dá)。在諸多哺乳動(dòng)物細(xì)胞中svv不僅具有抗凋亡的作用，而且在細(xì)胞分裂過程中也發(fā)揮著重要的作用。在家蠶(Bombyx mori)中也發(fā)現(xiàn)有svv(Bm

2、-svv)類似基因的存在，位于第17條染色體，開放閱讀框?yàn)?11 bp，編碼136個(gè)氨基酸。
　　 為了解家蠶該基因的功能，本論文進(jìn)行了如下的工作:
　　 (1)從家蠶中克隆了Bm-svv基因，分別構(gòu)建了表達(dá)載體pigA3-ie1-svv和桿狀病毒表達(dá)載體Bm-Bacmid-ie1-svv及Ac-Bacmid-ie1-svv;建立了昆蟲細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的模型，以H2O2分別誘導(dǎo)家蠶細(xì)胞(BmN)和草地貪夜蛾(Spodopte

3、ra frugiperda) Sf9細(xì)胞凋亡，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的活性，分析了H2O2的半效抑制濃度，即IC50;
　　 (2)通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-Time Quantitative PCR，RT-QPCR)分析Bm-svv的轉(zhuǎn)錄水平，從兩個(gè)方面來分析:一是用家蠶核型多角體病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV)感染家蠶BmN細(xì)胞，分析發(fā)現(xiàn)，Bm-svv在感染2h的

4、表達(dá)量最高，隨時(shí)間的推移有所降低;二是用H2O2的IC50劑量刺激BmN細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Bm-svv和IAP也都在刺激2h的表達(dá)量最高，隨時(shí)間的延長(zhǎng)緩慢降低，并且兩者表達(dá)的總體趨勢(shì)相近。這些結(jié)果表明，Bm-svv基因不論是在細(xì)胞受到病毒感染還是凋亡刺激時(shí)，在早期階段就有應(yīng)激表達(dá)。
　　 (3)將表達(dá)載體pigA3-ie1-svv和對(duì)照載體pigA3-ie1分別轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，用G418篩選穩(wěn)定化的細(xì)胞株。之后用H2O2的IC50劑

5、量分別刺激穩(wěn)定化轉(zhuǎn)染細(xì)胞。結(jié)果表明，穩(wěn)轉(zhuǎn)pigA3-ie1-svv細(xì)胞的凋亡率明顯低于對(duì)照組，具有顯著性差異。由此說明，Bm-svv具有抗凋亡的作用。
　　 (4)利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(Baculovirus expression vector system，BEVS)研究Bm-svv基因的功能。將重組桿狀病毒Bmie1-svv和Acie1-svv分別感染多種昆蟲細(xì)胞。結(jié)果表明，由病毒Bmie1-svv介導(dǎo)表達(dá)的Bm-svv具有

6、促進(jìn)粉紋夜蛾(Trichoplusia ni) Tn5、灰翅夜蛾(Spodoptera littoralis) Spli以及Sf9細(xì)胞增殖，由病毒Acie1-svv介導(dǎo)表達(dá)的Bm-svv能抑制BmN、Tn5細(xì)胞的凋亡以及減弱Spli細(xì)胞中凋亡小體的產(chǎn)生。表明由病毒介導(dǎo)表達(dá)的Bm-svv具有促進(jìn)細(xì)胞增殖及抑制病毒自身引起的細(xì)胞凋亡等作用。
　　 從上述的研究中得出以下結(jié)論:家蠶中存在促進(jìn)細(xì)胞增殖的svv基因，該基因還有具有對(duì)抗H2