家蠶谷胱甘肽-S-轉移酶BmGSTe3基因的克隆和真核表達.pdf

1、家蠶既是重要的經濟昆蟲，也是重要的模式生物。谷胱甘肽-S-轉移酶(GSTs)是一類由多基因編碼的多功能同工酶超家族，廣泛分布在動物、植物、酵母和細菌等生物體中，該酶系在解毒內源和外源性有毒物質中起著重要作用[1]。隨著社會經濟的迅速發(fā)展，越來越多的有機農藥應用于農業(yè)生產中，但是伴隨而來的是昆蟲的抗性也隨之加強。家蠶作為鱗翅目昆蟲的模式生物，研究家蠶谷胱甘肽-S-轉移酶的表達模式和調控機制，對于闡明谷胱甘肽-S-轉移酶與殺蟲劑抗性的關系，

2、防治農林害蟲有著重要的理論意義，本文采用生物信息學分析方法，依據家蠶基因組數據庫和EST數據庫信息，預測劍家蠶的谷胱甘肽-S-轉移酶基因BmGSTe3，采1用RT-PCR方法分析了其組織表達特性并進行了序列分析。利用基因工程技術，克隆谷胱甘肽-S-轉移酶后，通過桿狀病毒表達載體系統(tǒng)構建真核表達載體，對谷胱甘肽-S-轉移酶基岡進行了外源表達，初步建立和探索出了一條在昆蟲細胞中表達谷胱甘肽-S-轉移酶蛋白的路線。 1.BmGSTe3

3、基因的克隆和序列分析克隆了家蠶的BmGSTe3基因，該基因的完整編碼區(qū)序列長度為651bp，由5個外顯子與4個內含子組成，且所有的外顯子/內含子拼接邊界均符合典型的GT-AG規(guī)則，外顯子總長度為512bp，每個外顯子長度都不超過250bp。內含子總長度為4792bp，其中第一內含子最長，為1771bp，第二內含子最短，為7SSbp。BmGSTe3包含N-末端和C-末端兩個結構域，N-末端由β-α-β-α-β-β-α共7個結構基序組成，而

4、C-末端則由5個僅螺旋構成，有一個保守的Ser催化位點以神經網絡啟動子預測分析發(fā)現BmGSTe3有1個TATA盒，在上游2500bp區(qū)域內搜尋相關調控元件時，共發(fā)現了15個可能的轉錄調控元件，分別是：XRE(1)、ARE(4)、TRE(5)和NF-kB(5)。系統(tǒng)發(fā)生樹明顯分為四人類群，分別是Dlata、Epsilon、Theta和Zeta四大類。而家蠶BmGSTe3與昆蟲特異的Epsilon家族聚為一類。 2.BmGSTe3基

5、因組織表達特性BmGSTe3表達模式分析表明，BmGSTe3基因只有血淋巴和頭部有表達，在其余6個組織中不表達，并且在頭中表達量較血淋巴中高。表明BmGSTe3基因的表達具有較高的組織特異性。 3.重組轉移載體和桿狀病毒載體的構建與鑒定利用基因重組技術將重組克隆質粒PMD18-T/BmGSTe3和轉移載體pFastBacHTA進行了桿狀病毒轉移載體構建，得到了重組轉移載體pFastBacHTA-BmGSTe3。將重組的轉移載體p

6、FastBacHTA-BmGSTe3轉化大腸桿菌DHlOBac，獲得了含有BmGSTe3基因的重組病毒Bac-BmGSTe3。 4.BmGSTe3基因的真核表達運用cellfectinm轉染試劑將重組病毒轉染進入sf9細胞后，經SDS-PAGE分析鑒定，比較蛋白條帶，結果發(fā)現感染重組桿狀病毒Bacmid-BmGSTe3的細胞有一約為28KD左右的目的特異蛋白條帶表達。 5.GSTs酶活性測定以CDNB作底物，對重組表達蛋