家蠶腦組織基因表達譜和神經(jīng)肽及肽樣基因的功能研究.pdf

1、昆蟲的保幼激素和蛻皮激素依賴于不同發(fā)育時期滴度的交替變化和相對高低來調(diào)節(jié)昆蟲的生長與變態(tài)發(fā)育。而這兩類激素受到內(nèi)分泌系統(tǒng)中神經(jīng)肽的調(diào)控。蛻皮激素是昆蟲前胸腺合成和釋放的類固醇激素，腦神經(jīng)肽PTTH是促進蛻皮激素合成的重要因子。研究發(fā)現(xiàn)，除了PTTH而外，腦也產(chǎn)生了大量另外的神經(jīng)肽參與昆蟲蛻皮和變態(tài)發(fā)育的調(diào)控。如CCAP、AST-B和FMRFamide相關(guān)肽等。因此腦是昆蟲生長和發(fā)育的控制中心，對胚胎后的發(fā)育發(fā)揮了關(guān)鍵性的作用。盡管有關(guān)神

2、經(jīng)肽的研究已在另外的昆蟲，如果蠅上取得較大的進展，但對家蠶仍知之甚少。
　　 家蠶是鱗翅目昆蟲的典型代表，也是目前唯一完成基因組測序的鱗翅目昆蟲。由于同源的神經(jīng)肽基因在不同的物種上種類及功能不盡相同，因此在基因組測序信息成果之上展開家蠶腦神經(jīng)肽基因的系統(tǒng)研究實屬必要。首先，在家蠶中有多少神經(jīng)肽基因？能表達產(chǎn)生多少成熟肽？其次，伴隨發(fā)育，作為神經(jīng)肽分泌的主要組織部位-腦組織在形態(tài)上和分子水平上有怎樣的變化？與變態(tài)發(fā)育相關(guān)的腦神經(jīng)肽

3、基因呈現(xiàn)怎樣的表達模式?腦組織中什么類型的細胞表達了神經(jīng)肽及肽樣基因？再次，這些基因具有怎樣的發(fā)育調(diào)控功能？這些問題尚需要深入探討。對變態(tài)發(fā)育時期家蠶腦組織相關(guān)基因尤其是腦神經(jīng)肽及肽樣基因的研究，不僅有助于尋求家蠶變態(tài)及發(fā)育的控制因子，為延長或者自動終止蛹期發(fā)育提供重要的信息。而且能進一步加深我們對鱗翅目昆蟲變態(tài)發(fā)育及其控制機制的理解，對開發(fā)害蟲防治新途徑及生物環(huán)保型新農(nóng)藥等都具有重大意義。
　　 本研究借鑒家蠶及其以外的昆蟲尤

4、其是模式生物-果蠅關(guān)于神經(jīng)肽基因的研究成果，利用家蠶的全基因組序列、家蠶腦組織基因芯片數(shù)據(jù)，對家蠶不同發(fā)育時期腦組織發(fā)育表達相關(guān)基因尤其是神經(jīng)肽基因進行了生物信息學(xué)分析，同時采用RT-PCR、原位雜交、激素誘導(dǎo)(In vivo和In vitro)及RNA干涉等技術(shù)對AST-C、NPLP4基因的表達以及功能進行了研究。主要的研究結(jié)果如下：
　　 1.家蠶神經(jīng)肽基因的篩查及成熟肽的預(yù)測
　　 神經(jīng)肽(Neuropeptide

5、)是家蠶Bombyx mori體內(nèi)重要的調(diào)控物質(zhì)。為了充分理解神經(jīng)肽對家蠶發(fā)育的調(diào)控，擴充家蠶神經(jīng)肽的數(shù)量，本研究利用BLAST的Tblastn程序結(jié)合Openoffice軟件的查找程序，基于其他昆蟲和無脊椎動物神經(jīng)肽的同源性和保守的結(jié)構(gòu)特點，在家蠶基因、理論蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫及NCBI中進行全面而系統(tǒng)的基因篩查；并利用各種在線工具對所篩查到基因和理論蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和成熟肽進行預(yù)測分析。
　　 結(jié)果共獲得31個神經(jīng)肽基因家族(不包括bo

6、mbyxin家族)，包括37個神經(jīng)肽基因亞家族，共計44個神經(jīng)肽基因；預(yù)測出192個成熟的神經(jīng)肽，其中73個根據(jù)家族同源性預(yù)測在C末端發(fā)生酰胺化，而6個被預(yù)測在N末端發(fā)生了環(huán)化，9個被預(yù)測酪氨酸被硫酸化。結(jié)果提示，除了加壓素樣肽(Vasopressin-like peptide)，家蠶體內(nèi)產(chǎn)生了幾乎在所有昆蟲中具有的神經(jīng)肽前體；進化過程中大部分成熟神經(jīng)肽的氨基酸序列在種間產(chǎn)生了差異，但家族特征性基序高度保守，暗示不同種類昆蟲生長發(fā)育的調(diào)

7、控途徑可能比較保守。盡管大部分成熟神經(jīng)肽都具有明顯的家族結(jié)構(gòu)特征，但Proctolin、CCAP及CAPA-PK成熟肽結(jié)構(gòu)上與其他昆蟲相比有所擴展，暗示進化過程的推進使昆蟲部分神經(jīng)肽結(jié)構(gòu)逐漸分化而表現(xiàn)出各自種群的特征。本研究為神經(jīng)肽功能研究以及神經(jīng)肽對家蠶發(fā)育尤其是蛹期發(fā)育調(diào)控的研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 2.基于芯片技術(shù)考察家蠶腦組織的基因表達特征
　　 分子遺傳學(xué)的研究已經(jīng)大大地推進了人們對家蠶發(fā)育調(diào)控的理解。家蠶腦組織

8、，作為主要的內(nèi)分泌器官，在家蠶不同的生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要的作用。掃描電鏡有助于我們清晰地觀察不同發(fā)育時期腦組織形態(tài)的變化。芯片技術(shù)為家蠶腦組織基因的表達模式分析提供了條件。
　　 在本研究中我們利用掃描電鏡觀察了家蠶腦組織在7個發(fā)育時期，包括家蠶幼蟲的5齡5天(V5)、5齡7天(V7)、上簇第2天(W)、化蛹1天(P1)、化蛹3天(P3)、化蛹5天(P5)及化蛹7天(P7)腦組織形態(tài)的變化，并基于全基因組芯片考察了家蠶腦組織的

9、基因表達特征。結(jié)果表明，家蠶5齡幼蟲腦組織形態(tài)圓潤，到幼蟲末期，即變態(tài)蛻皮前期，形態(tài)變化劇烈，而進入蛹期大量色斑在腦組織表面沉積，形態(tài)越發(fā)不規(guī)則，暗示腦組織作為變態(tài)發(fā)育控制中心的同時，其形態(tài)也受到20羥基蛻皮激素的調(diào)控。
　　 芯片分析結(jié)果顯示總共有4，550個基因至少在一個時期轉(zhuǎn)錄。聚類分析將這些表達的基因分為了兩大類：即穩(wěn)定表達基因和可變表達基因。穩(wěn)定表達基因的GO和KEGG分析結(jié)果顯示，核糖體和氧化磷酸化途徑是家蠶腦組織主

10、要的代謝途徑。其次，K-均值聚類分析將1，175個可變表達基因劃分為具有明顯不同表達模式的四簇基因，簇Ⅰ和簇Ⅲ的基因分別在V7和P5高量表達，且表達的基因數(shù)量最多，這與V7和P5時期腦組織形態(tài)變化劇烈相吻合，推測在這兩簇中，部分基因與腦組織的形態(tài)變化有關(guān)。再次，利用同源性序列比對，鑒定了6個家蠶假定的神經(jīng)肽樣前體4基因，主要分布在Nscaf3031的11號染色體，其理論蛋白碳末端通常有三個高度保守的氨基酸YYX(X通常為L，V，I，G)

11、。芯片數(shù)據(jù)結(jié)果顯示32個神經(jīng)肽基因，6個NPLP4基因及117個表皮蛋白基因在所考察時期的家蠶腦組織表達。本研究進一步加深了我們對家蠶腦組織在發(fā)育過程中形態(tài)變化的理解，而腦組織表達基因的分析將為家蠶腦組織相關(guān)基因，尤其是神經(jīng)肽及肽樣物質(zhì)的進一步功能研究提供重要的信息。
　　 3.家蠶假定C型咽側(cè)體抑制素基因的表達及功能研究
　　 咽側(cè)體抑制素(Allatostatin，AST)是昆蟲體內(nèi)一組非常重要的神經(jīng)肽。根據(jù)結(jié)構(gòu)的不

12、同，可劃分為A-型咽側(cè)體抑制素(AST-A)；B-型咽側(cè)體抑制素(AST-B)及C-型咽側(cè)體抑制素(AST-C)。前述的家蠶腦組織芯片數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，在我們考察的發(fā)育時期，僅發(fā)現(xiàn)AST-C基因有表達，且在家蠶蛻皮變態(tài)前期高量表達，而進入蛹期則表達量下降，呈現(xiàn)出與PTTH基因相同的發(fā)育表達模式。暗示家蠶假定的AST-C可能與PTTH-樣參與了家蠶變態(tài)發(fā)育的調(diào)控，為了明確該基因的發(fā)育調(diào)控模式及功能，我們對家蠶AST-C基因進一步展開研究。

13、r>　　 不同物種AST-C氨基酸序列的同源性比對結(jié)果顯示，在非保守區(qū)域，氨基酸序列差異非常大，但AST-C成熟肽氨基酸序列非常保守，暗示其功能的保守性。本研究在芯片數(shù)據(jù)分析結(jié)果之上，利用RT-PCR技術(shù)進一步比較分析了AST-C和PTTH基因的時空表達特征，結(jié)果顯示AST-C和PTTH基因都在5齡7天的腦、前胸腺表達，除此而外，AST-C也在中腸表達，推測其可能參與了變態(tài)前中腸的發(fā)育調(diào)控。不同時期家蠶腦組織及CNS的發(fā)育表達特征顯示

14、，這兩個基因表達模式非常相似，都在化蛹前高量表達，進入蛹期后降低，在蛹后期又上升。全包埋原位雜交定位表達分析結(jié)果表明，AST-C基因在腦組織外側(cè)一對神經(jīng)分泌細胞中表達，與PTTH基因的表達具有共位性，暗示AST-C與PTTH基因以相同的表達模式共同參與了變態(tài)發(fā)育調(diào)控。功能研究顯示，AST-C基因的干涉延遲了家蠶幼蟲的化蛹。結(jié)合煙草天蛾體外的研究成果，即AST-C成熟肽能抑制咽側(cè)體CA保幼激素JH的合成，暗示家蠶為了節(jié)約生物組織空間，采用

15、相同的細胞表達變態(tài)調(diào)控所需的“蛻皮激素促進因子”和“保幼激素抑制因子”。為此我們提出以下的發(fā)育調(diào)控模式：家蠶腦組織通過相同的分泌細胞表達不同的神經(jīng)肽以相同的表達模式分別促進蛻皮激素合成和抑制保幼激素的合成，從而調(diào)控家蠶的變態(tài)發(fā)育。
　　 4.家蠶假定神經(jīng)肽樣前體4基因的表達及功能研究
　　 神經(jīng)肽樣前體基因首先在果蠅中樞神經(jīng)系統(tǒng)肽組學(xué)分析中被證實并命名。前述的研究結(jié)果顯示，一組家蠶假定的NPLP4基因在所考察時期家蠶的腦

16、組織表達。為了加深對家蠶腦組織發(fā)育表達相關(guān)基因的理解，挖掘更多的未知功能基因，我們進一步展開了NPLP4基因的功能研究。
　　 RT-PCR分析結(jié)果顯示，NPLP4基因在5齡3天至化蛹7天發(fā)育時期腦組織及中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS，不包括腦)中呈不同的表達模式。NPLP4C僅在化蛹7天的腦組織及CNS中高量表達，而其余幾個NPLP4基因在5齡5天的腦組織表達水平微弱，進入5齡末期和化蛹3天后則表達水平增加。NPLP4A、NPLP4E及

17、NPLP4F基因突出地在變態(tài)時期的CNS中表達劇烈增加，另外NPLP4E在化蛹3天后表達水平增加，這些可能都與家蠶蛻皮激素在幼蟲末期及蛹發(fā)育后期出現(xiàn)滴度峰相吻合。20E和JH對5齡5天家蠶腦組織實施體外誘導(dǎo)結(jié)果顯示，除了NPLP4C基因外，20E誘導(dǎo)了NPLP4基因的表達。而JH抑制了NPLP4A、E及F基因的表達，不同的基因?qū)?0E誘導(dǎo)呈不同的濃度和劑量反應(yīng)關(guān)系。20E對5齡5天家蠶實施體內(nèi)誘導(dǎo)，結(jié)果顯示，不同注射劑量的家蠶與對照組相

18、比都提前進入蛹期。除NPLP4C基因而外，注射不同劑量的20E在不同時間點對家蠶腦組織NPLP4基因的表達都有一定的誘導(dǎo)效應(yīng)。體內(nèi)體外的激素誘導(dǎo)實驗暗示，不同的NPLP4基因?qū)?0E和JH有不同的反應(yīng)模式。5齡7天家蠶腦組織全包埋原位雜交結(jié)果顯示，NPLP4A和NPLP4E基因在腦間部的中間神經(jīng)分泌細胞表達，而NPLP4F基因則在腦的蘑菇體神經(jīng)纖維網(wǎng)區(qū)域表達。NPLP4基因在家蠶腦組織細胞不同的分布及表達模式，暗示其可能受到不同調(diào)控途徑

19、的調(diào)節(jié)。NPLP4E基因的干涉導(dǎo)致成蟲翅邊緣發(fā)育缺陷，暗示該基因參與了成蟲組織的形成，這也可能是導(dǎo)致NPLP4E基因在化蛹3天后在腦和CNS中表達水平增高的原因。針對NPLP4A基因的RNAi導(dǎo)致了16.67％幼蟲到蛹的蛻皮缺陷，暗示該基因也許參與了家蠶的蛻皮。而NPLP4F基因的干涉則導(dǎo)致了幼蟲到蛹發(fā)育的延遲，推測該基因參與了家蠶幼蟲的變態(tài)發(fā)育。上述對NPLP4基因的功能研究結(jié)果表明，不同的NPLP4基因功能途徑不相同，而具體有關(guān)NP