家蠶表皮幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白的純化與鑒定.pdf

1、家蠶作為一種完全人工馴化的經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)，擁有良好的飼養(yǎng)體系和遺傳繁殖體系，其個(gè)體適中，已被認(rèn)為是研究鱗翅目昆蟲(chóng)理想的模式生物之一。2004年家蠶基因組測(cè)序完成，大量的序列信息得到注釋。結(jié)合家蠶cDNAs序列，構(gòu)建了家蠶理論蛋白質(zhì)庫(kù)，為家蠶蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了檢索數(shù)據(jù)庫(kù)。
　　 昆蟲(chóng)表皮是覆蓋機(jī)體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)，是蟲(chóng)體直接與外在環(huán)境接觸的界面，行使多種生物學(xué)功能。為昆蟲(chóng)提供有效的保護(hù)，以抵御環(huán)境中有害因素的影響；提供可變的機(jī)械性能，營(yíng)造

2、昆蟲(chóng)發(fā)育的最優(yōu)環(huán)境。
　　 昆蟲(chóng)表皮主要由幾丁質(zhì)和蛋白質(zhì)基質(zhì)組成。表皮蛋白和幾丁質(zhì)通過(guò)自我組裝形成復(fù)合物的超高級(jí)結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)是昆蟲(chóng)表皮行使功能的基礎(chǔ)。序列分析發(fā)現(xiàn)與幾丁質(zhì)結(jié)合的蛋白質(zhì)即使在不同物種中，仍然擁有較保守的結(jié)構(gòu)域，且在表皮中扮演著重要的角色，其中主要的是由Rebers和Riddiford發(fā)現(xiàn)的“R&R”共有序列。研究證實(shí)了具有“R&R”結(jié)構(gòu)域的表皮蛋白能與幾丁質(zhì)結(jié)合。而體外表達(dá)實(shí)驗(yàn)卻發(fā)現(xiàn)具有CPF結(jié)構(gòu)域的表皮蛋白不能

3、與幾丁質(zhì)結(jié)合。
　　 本實(shí)驗(yàn)利用強(qiáng)陰離子去污劑SDS抽提家蠶幼蟲(chóng)表皮中難溶的幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白。透析去除SDS后，將得到的蛋白質(zhì)樣品用于體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)，分離得到與幾丁質(zhì)結(jié)合的蛋白質(zhì)組分。進(jìn)一步采用LC-MS/MS串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行鑒定。在檢測(cè)得到的90個(gè)可信肽段中，85個(gè)肽段匹配得到22個(gè)蛋白質(zhì)。其中有38個(gè)肽段指向9個(gè)預(yù)測(cè)的表皮蛋白，平均覆蓋度約為23％。這些表皮蛋白包括7個(gè)RR-1蛋白、一個(gè)Tweedle蛋白、一個(gè)RR-3蛋白。除了表皮

4、蛋白外，本實(shí)驗(yàn)還鑒定了13個(gè)其它蛋白，包括2個(gè)溶菌酶、2個(gè)具有Ⅱ型幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)域的蛋白、2個(gè)ATP合成酶以及30K蛋白、載脂蛋白Ⅲ、脂肪酶、啟動(dòng)蛋白肽酶類似蛋白、肌肉蛋白20、和未知功能蛋白。根據(jù)質(zhì)譜鑒定數(shù)據(jù)，選取兩個(gè)分別具有RR-1和Tweedle結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)BmorCPR56和BmorCPT1基因用于原核表達(dá)，模擬天然蛋白進(jìn)行體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)。使用特異的引物擴(kuò)增得到501 bp的BmorCPR56和1383 bp的BmorCPT1 cD

5、NA序列。然后分別將它們插入PGEX-4T-1載體，位于編碼GST序列之后，并測(cè)序確認(rèn)。以大腸桿菌BL21(DE3)作為表達(dá)菌株，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白。經(jīng)超聲波破碎菌體釋放目蛋白，并用GST親和層析進(jìn)一步純化得到目的蛋白。原核表達(dá)BmorCPR56的成熟肽為166個(gè)氨基酸，BmorCPR56-GST融合蛋白的分子量約為45 kDa。BmorCPT1蛋白的成熟肽有460個(gè)氨基酸，BmorCPT1-GST融合蛋白的分子量約為77 kDa