家蠶膜蛋白PRMC2的分離純化與結(jié)晶初探.pdf

1、膜蛋白是一類結(jié)構(gòu)獨(dú)特功能強(qiáng)大的蛋白質(zhì)，執(zhí)行多種基本而又重要的細(xì)胞生物學(xué)功能，如:物質(zhì)的運(yùn)輸，膜內(nèi)外信號的傳遞及能量轉(zhuǎn)換等，是多種藥物的作用靶點(diǎn)。但是，膜蛋白含量低、疏水性強(qiáng)、水溶性不好，且大部分存在糖化、乙?；⒓谆确g后修飾，造成膜蛋白在結(jié)構(gòu)上的特異性，對當(dāng)前的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)提出了巨大的挑戰(zhàn)。因此，如何分離純化和鑒定生物膜上的膜蛋白，特別是膜內(nèi)在蛋白，是生物膜蛋白組學(xué)現(xiàn)階段研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。
　　 家蠶桿狀病毒在細(xì)胞的感染

2、晚期以出芽病毒的方式穿過宿主細(xì)胞膜，被病毒穿膜后的宿主破碎細(xì)胞膜融合后形成細(xì)胞膜囊泡。本文以家蠶桿狀病毒感染晚期的蠶蛹為材料，經(jīng)過勻漿、低速離心、超速離心、密度梯度離心等一系列技術(shù)手段，獲得較純的細(xì)胞膜囊泡，然后采用含有兩性離子去垢劑(CHAPS)的膜蛋白提取液從細(xì)胞膜囊泡中提取膜蛋白。利用自制的PRMC2抗體親和層析柱初步對目的蛋白進(jìn)行分離純化，再利用AKTAexplorer10蛋白純化系統(tǒng)的離子交換層析和凝膠過濾層析進(jìn)一步分離純化，

3、獲得的蛋白樣品最后經(jīng)過雙向電泳進(jìn)一步分離后，通過MALDI-TOF-MS質(zhì)譜分析鑒定為家蠶膜蛋白孕酮受體膜組件2(Progesteronereceptormembranecomponent2簡稱PRMC2)。
　　 為了探索PRMC2的蛋白三維結(jié)構(gòu)，我們采用懸滴法結(jié)晶來進(jìn)行研究，由于天然膜蛋白豐度很低，不利于大量富集進(jìn)行結(jié)晶研究，因此，我們通過構(gòu)建兩種重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-PRMC2和pET-28a-MnSOD-PRM

4、C2，并在大腸桿菌中表達(dá)，通過鎳柱和陰離子交換層析分離純化該目的蛋白，將純化后的目的蛋白進(jìn)行結(jié)晶條件探索，并得到PRMC2蛋白的針狀簇形不規(guī)則蛋白質(zhì)晶體。
　　 為了對該蛋白結(jié)晶進(jìn)一步探索和優(yōu)化，我們將該蛋白疏水區(qū)的跨膜域和親水區(qū)的功能域進(jìn)行分段表達(dá)，分別構(gòu)建pET-28a-PRMC2TM（TM為跨膜域的簡寫）和pET-28a-PRMC2FT（FT為功能域的簡寫），并在大腸桿菌中表達(dá)，通過鎳柱和陰離子交換層析分離純化這兩種目的蛋