家蠶BmCP8蛋白的功能初探與分析.pdf

1、無論是在脊椎或無脊椎動(dòng)物中,胰島素/胰島素樣生長(zhǎng)因子信號(hào)系統(tǒng)調(diào)控著生物個(gè)體的代謝與生長(zhǎng)發(fā)育。作為該系統(tǒng)中一種重要的效應(yīng)因子,胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白(IGFBPs)家族對(duì)維持體內(nèi)血糖平衡,促進(jìn)細(xì)胞的增殖分化等生命過程發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。昆蟲也具有胰島素樣肽,而目前對(duì)無脊椎動(dòng)物IGFBPs的功能同系物少有報(bào)道。
　　 作為昆蟲先天性免疫系統(tǒng)中一個(gè)重要的組成部分,酚氧化酶原級(jí)聯(lián)反應(yīng)在宿主抵御外源微生物侵染的過程中發(fā)揮著重要的作用。

2、其通過產(chǎn)生黑色素,以毒性的醌類物質(zhì)和活性氧、氮中間產(chǎn)物對(duì)微生物進(jìn)行殺滅。但過度黑化會(huì)導(dǎo)致機(jī)體損傷,所以需要如絲氨酸蛋白酶抑制劑這樣的負(fù)調(diào)控因子對(duì)黑化反應(yīng)進(jìn)行精確控制。
　　 家蠶具有開放式血液循環(huán)系統(tǒng),血淋巴中的蛋白會(huì)參與新陳代謝,物質(zhì)能量轉(zhuǎn)運(yùn)以及免疫防控。本文通過對(duì)家蠶血淋巴蛋白BmCP8的功能進(jìn)行了初步分析,發(fā)現(xiàn)其可能是一種具有雙重功能的家蠶血淋巴堿性小分子量蛋白,即參與了兩種不同的生命進(jìn)程:胰島素樣肽通路和黑化反應(yīng)。主要的

3、研究結(jié)果如下:
　　 1.家蠶BmCP8蛋白的生物信息學(xué)分析
　　 根據(jù)BmCP8的氨基酸序列,通過Uniprot的UniprotKB數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLASTP發(fā)現(xiàn)BmCP8與柞蠶真菌蛋白酶抑制劑AmFPI-1以及哺乳動(dòng)物的IGFBPs的N端保守區(qū)域相似,其序列上都富含半胱氨酸。進(jìn)行多重序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn),BmCP8具有AmFPI-1的活性區(qū)域,而BmCP8的"GCGCCXXCV"序列與IGFBPsN端結(jié)構(gòu)域中保守的"GCGCC

4、XXCA"序列相似。
　　 2.家蠶BmCP8蛋白的純化與富集
　　 為了大量富集BmCP8蛋白,本研究在原有純化策略的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn),即將五齡三天的家蠶血液通過硫酸銨沉淀法,兩次凝膠過濾與一次離子交換層析的策略純化出單一的目的蛋白。
　　 3.不同時(shí)期高糖飼料喂養(yǎng)家蠶后表型和BmCP8基因表達(dá)的分析
　　 從三齡起和五齡起分別用含5%和20%葡萄糖的人工飼料喂養(yǎng)家蠶,于五齡三天對(duì)各處理組進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析

5、,以及調(diào)查其脂肪體中BmCP8基因和頭中BombyxinA2基因的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),加糖飼料喂養(yǎng)的家蠶個(gè)頭小,發(fā)育遲緩。同時(shí),長(zhǎng)期喂食含糖飼料使得BombyxinA2和BmCP8基因表達(dá)水平也在各處理組中呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì)。
　　 4.BmCP8蛋白對(duì)家蠶卵巢細(xì)胞生長(zhǎng)情況的影響
　　 用不同濃度(0、0.5、1、5、10μg/孔)的BmCP8蛋白與處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的卵巢細(xì)胞共培養(yǎng),用家蠶表皮蛋白CPR56作為蛋白對(duì)照。培養(yǎng)

6、48小時(shí)后,對(duì)卵巢細(xì)胞生長(zhǎng)情況進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)BmCP8并不能促進(jìn)其生長(zhǎng)。
　　 5.BmCP8蛋白對(duì)酚氧化酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的影響
　　 對(duì)五齡三天的家蠶幼蟲分別注射大腸桿菌(Eescherichiacoil)、白僵菌(Beauveriabassiana)、黑胸?cái)⊙挎邨U菌(Bacillusbornbyseptieus)和對(duì)照(0.85%生理鹽水),選取5個(gè)時(shí)間點(diǎn)即1、3、6、12、24小時(shí)。通過熒光定量PCR檢測(cè)BmCP8的表達(dá)